En nuestro laboratorio se demostró en líneas celulares tumorales, que monoterpenos como geraniol, cineole, limoneno y linalool poseen propiedades hipocolesterogénicas y antiproliferativas y que éstas a su vez son potenciadas de manera sinérgica al combinar los compuestos individuales (Kladniew et al. 2014; Manassero et al. 2013; M P Polo, Crespo, and De Bravo 2011). Por otro lado, existen numerosos reportes bibliográficos acerca del efecto antioxidante que poseen distintos aceites esenciales y/o sus componentes individuales. A partir de estos resultados se planteó que el aceite de la cáscara de mandarina (ACM) Citrus reticulata Blanco variedad Dancy, que posee una mezcla de varios isoprenoides, presenta un gran potencial en el tratamiento de hipercolesterolemias, prevención de ateroesclerosis y enfermedades tumorales. Para ello nos propusimos estudiar la capacidad de este aceite de modular vías metabólicas lipídicas asociadas al desarrollo de estas patologías. Se evaluaron los mecanismos bioquímicos y moleculares que desencadena el ACM a fin de aportar conocimiento sobre su potencial utilidad terapéutica en reemplazo o complemento de terapias existentes en el tratamiento de hipercolesterolemias, prevención de enfermedades cardiovasculares y como quimiopreventivos y/o quimioterapéuticos. Se determinó la composición lipídica del ACM empleando técnicas cromatográficas y espectofotométricas. Se evaluó el potencial antiaterogénico estudiando los efectos y mecanismos del aceite sobre la síntesis de lípidos, en particular sobre la vía del mevalonato (VM) empleando precursores radiactivos en un modelo de célula hepática humana (HepG2). Se estudiaron los efectos del aceite sobre el depósito de lípidos de reserva citoplasmática en células espumosas obtenidas por diferenciación de macrófagos (RAW 264.7) incubados con lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas; así como el efecto en los niveles de expresión de enzimas responsables de la síntesis y degradación de los mismos. Además se analizó el efecto antioxidante del aceite sobre las LDL involucradas en el proceso de formación de placas ateroscleróticas. Para evaluar el potencial antitumoral del ACM se estudiaron los efectos y mecanismos de acción del aceite sobre la viabilidad, proliferación y muerte celular en un modelo de célula tumoral humana (A549) realizando ensayos bioquímicos-moleculares en células en cultivo (ensayos in vitro) e implantadas en ratones atímicos (ensayos in vivo). Se analizó además el efecto del aceite sobre el estado redox celular evaluando los niveles de peroxidación lipídica y la actividad de enzimas del sistema antioxidante en células A549. El ACM contiene compuestos volátiles y no volátiles. Más del 90% de la fracción volátil corresponde al limoneno (Li) y el resto a distintos compuestos isoprenoides. En la fracción no volátil se encuentran: triacilglicéridos y carotenoides (libres y esterificados). Los efectos de bajas concentraciones del aceite que no disminuyen la viabilidad celular (<60 μL/L) sobre el metabolismo lipídico en hepatocitos mostraron una inhibición de la síntesis de colesterol con un aumento la incorporación de acetato en los intermediarios de la VM, escualeno y lanosterol. En cambio altas concentraciones del ACM (≥60 μL/L), disminuyen en hepatocitos no sólo la síntesis de colesterol, sino también la incorporación de acetato en todos los intermediarios de la VM evaluados. En células espumosas se observó una disminución del contenido de lípidos neutros. La disminución de los niveles de expresión de GPAT3 observada estaría contribuyendo a la reducción del contenido lipídico en estas células. El ACM posee mayor efecto inhibitorio sobre la viabilidad celular de las líneas tumorales estudiadas que su componente mayoritario el Li, lo que sugiere que la combinación de los distintos compuestos presentes en el ACM, generaría un efecto sinérgico o aditivo sobre la inhibición de la viabilidad celular de HepG2 y A549. El aceite bloquea la progresión del ciclo celular de las células A549 (línea tumorigénica). Las concentraciones evaluadas del ACM causaron un aumento en la población de células en fase G2/M con una simultánea disminución de células en fase S y las células tratadas con las concentraciones más altas del ACM (IC50) mostraron cambios significativos en todas las etapas del ciclo, promoviendo un arresto más pronunciado en la fase G0/G1 con disminución de los niveles de ciclina E, aumento de los de ciclina B1 en ambas concentraciones estudiadas y sin diferencias significativas en la expresión de ciclina D1. Además, la cuantificación de las imágenes obtenidas en células A549 por microscopía de fluorescencia demostró que tanto bajas (IC25) como altas concentraciones (IC50) del ACM ocasionaron un incremento significativo del porcentaje de células TUNEL positivo, evidenciando un efecto pro-apoptótico del aceite. Los ensayos in vivo demostraron una reducción significativa en el crecimiento tumoral cuando se le administró a los animales una dosis de 5.25 mg ACM/ratón/día en el alimento. El ACM incrementó la apoptosis en células tumorales in vivo. No se observaron cambios significativos en la ingesta de alimento, peso corporal, peso e histología de órganos ni en parámetros bioquímicos séricos de toxicidad hepática en ratones tratados con el ACM. El análisis por Western blot mostró que los niveles de Ras unida a membrana disminuyeron significativamente en los tumores de ratones tratados con 5.25 mg ACM/ratón/día, con respecto a los tumores control. Esta proteína anclada a la membrana desempeña un papel central en la promoción de la proliferación celular. Sin embargo, los niveles totales de Ras no variaron significativamente en ninguno de los grupos experimentales. Se observó una tendencia al aumento en los niveles de peroxidación lipídica en tumor, así como una disminución de los mismos en hígado. Por último el ACM disminuyó los niveles de peroxidación lipídica en LDL humanas y en células en cultivo incubadas con un agente inductor de estrés oxidativo e incrementó en las células en cultivo, en un estado redox fisiológico, la actividad de enzimas fundamentales del sistema antioxidante celular como son catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD) y glutatión-S-transferasa (GST). Los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo demuestran que el ACM, a través de múltiples mecanismos, ejerce un efecto antiproliferativo y antilipogénico que permite sugerir su utilidad terapéutica en reemplazo o complemento de terapias existentes en el tratamiento de hipercolesterolemias, prevención de enfermedades cardiovasculares y como quimiopreventivo y/o quimioterapéutico.
Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometria de fluxo e Western blot