SAF-A mutants disrupt chromatin structure through dominant negative effects on RNAs associated with chromatin

Here we provide a brief review of relevant background before presenting results of our investigation into the interplay between scaffold attachment factor A (SAF-A), chromatin-associated RNAs, and DNA condensation. SAF-A, also termed heterogenous nuclear protein U (hnRNP U), is a ubiquitous nuclear scaffold protein that was implicated in XIST RNA localization to the inactive X-chromosome (Xi) but also reported to maintain open DNA packaging in euchromatin. Here we use several means to perturb SAF-A and examine potential impacts on the broad association of RNAs on euchromatin, and on chromatin compaction. SAF-A has an N-terminal DNA binding domain and C-terminal RNA binding domain, and a prominent model has been that the protein provides a single-molecule bridge between XIST RNA and chromatin. Here analysis of the impact of SAF-A on broad RNA-chromatin interactions indicate greater biological complexity. We focus on SAF-A’s role with repeat-rich C0T-1 hnRNA (repeat-rich heterogeneous nuclear RNA), shown recently to comprise mostly intronic sequences of pre-mRNAs and diverse long non-coding RNAs (lncRNAs). Our results show that SAF-A mutants cause dramatic changes to cytological chromatin condensation through dominant negative effects on C0T-1 RNA’s association with euchromatin, and likely other nuclear scaffold factors. In contrast, depletion of SAF-A by RNA interference (RNAi) had no discernible impact on C0T-1 RNA, nor did it cause similarly marked chromatin changes as did three different SAF-A mutations. Overall results support the concept that repeat-rich, chromatin-associated RNAs interact with multiple RNA binding proteins (RBPs) in a complex dynamic meshwork that is integral to larger-scale chromatin architecture and collectively influences cytological-scale DNA condensation.

Investigations on protein arginine methyltransferases in differentiation and cancer

Η μεθυλίωση των καταλοίπων αργινίνης από την οικογένεια των μεθυλοτρανσφερασών της αργινίνης (Protein Arginine Methyltransferases, PRMTs) είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της λειτουργίας των πρωτεϊνών και εμπλέκεται σε διαδικασίες όπως: η επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, οι αποκρίσεις σε βλάβες του γενετικού υλικού, η ωρίμανση του RNA και η κυτταρική σηματοδότηση. Ο κυριότερος εκπρόσωπος της οικογένειας των ενζύμων αυτών είναι η PRMT1, από το γονίδιο της οποίας παράγονται εφτά διαφορετικές ισομορφές μετά από εναλλακτικό μάτισμα του αρχικού μεταγράφου στο 5’ άκρο. Οι ισομορφές αυτές εκφράζονται σε διαφορετικά επίπεδα ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο, επιδεικνύουν διακριτή ειδικότητα για συγκεκριμένα υποστρώματα καθώς και διαφορετικό υποκυττάριο εντοπισμό. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, ανακαλύψαμε μια νέα ισομορφή της PRMT1 που δε σχετίζεται με το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης, όπως οι εφτά γνωστές έως τώρα ισομορφές. Η νέα αυτή ισομορφή δεν εμπεριέχει τα εξόνια 8 και 9 τα οποία είναι υπεύθυνα για την κωδικοποίηση του βραχίονα διμερισμού του ενζύμου. Εξαιτίας αυτού, το ένζυμο δεν μπορεί να δημιουργήσει καταλυτικά ενεργά ολιγομερή με τις υπόλοιπες ισομορφές του. Πειράματα FRAP (Fluorescent Recovery After Photobleaching) έδειξαν την ύπαρξη ενός ακινητοποιημένου κλάσματος της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σύμφωνα με παλιότερα ευρήματα του εργαστηρίου μας, που έδειξαν ότι υπάρχει ισχυρή πρόσδεση της ανενεργής ή ανεσταλμένης PRMT1 στη χρωματίνη και στο πυρηνικό ικρίωμα (nuclear scaffold). Η νέα ισομορφή μπορεί να προσδεθεί στα ίδια υποστρώματα με την ενζυματικά ενεργή PRMT1. Η έκφραση της ανιχνεύθηκε σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και ήταν αυξημένη σε αυτές με τα πιο έντονα καρκινικά χαρακτηριστικά ή μετά από την υπερέκραφαση του μεταγραφικού παράγοντα Snail που επάγει τη μετάπτωση από επιθήλιο σε μεσέγχυμα (ΕΜΤ). Θεωρούμε ότι η νέα ισομορφή μπορεί να λειτουργήσει ως ρυθμιστής της δράσης της PRMT1 στα καρκινικά κύτταρα, δρώντας ως ανταγωνιστικός αναστολέας που δεν επιτρέπει την πρόσβαση των ενεργών ολιγομερών της PRMT1 στα υποστρώματά τους. Επίσης, παρουσιάζουμε νέα δεδομένα που καταδεικνύουν ότι ο υποδοχέας της λαμίνης Β (Lamin B Receptor, LBR) αποτελεί υπόστρωμα της PRMT1, κάτι που δεν ήταν γνωστό μέχρι σήμερα. Η μεθυλίωση του LBR από την PRMT1, πιθανώς να αποτελεί μέρος της επιγενετικής ρύθμισης των γονιδίων μέσω υποστρωμάτων που δεν ανήκουν στην οικογένεια των ιστονών. Στο δεύτερο τμήμα της διδακτορικής διατριβής, μελετήσαμε την PRMT8, το όγδοο μέλος της οικογένειας των PRMTs. Η αλληλουχία της PRMT8 είναι κατά ένα μεγάλο ποσοστό ομόλογη με αυτήν της PRMT1, αλλά η έκφραση της είναι περιορισμένη στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Μέχρι σήμερα, η PRMT8 δεν είχε μελετηθεί ενδελεχώς, εξαιτίας της έλλειψης κατάλληλων εργαλείων και κυτταρικών συστημάτων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναπτύξαμε νέα εργαλεία και διεξαγάγαμε μία σειρά πειραμάτων με σκοπό να διερευνήσουμε τον φυσιολογικό ρόλο της PRMT8 στη διαφοροποίηση και τη διατήρηση του νευρικού ιστού. Από τα πειράματα μας, προκύπτει ότι η PRMT8 εκφράζεται ενδογενώς στο κυτταρικό μοντέλο νευρικής διαφοροποίησης, LUHMES (LUnd Human MESencephalon). Η υπερέκφραση της PRMT8, συντηγμένης με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein, GFP), κατέδειξε ότι η PRMT8 συσσωρεύεται στον πυρήνα καθώς τα LUHMES διαφοροποιούνται. Βάσει των αποτελεσμάτων μας φαίνεται ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης στον πυρήνα δεν μπορούν να ξεπεράσουν ένα όριο ανεξάρτητα από τη συνολική ποσότητά της στο κύτταρο. Τέλος, κατασκευάσαμε και αξιολογήσαμε νέους φορείς λέντι-ιών για την αποσιώπηση της έκφρασης της PRMT8 και την ανίχνευση μορίων με τα οποία αλληλεπιδρά μέσω της μεθόδου που ονομάζεται BioID. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής μου αποδεικνύουν ότι η PRMT1 και η PRMT8 επιτελούν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο και στη νευρική διαφοροποίηση, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά θα έχουν μεγάλη χρησιμότητα σε επόμενες μελέτες όπου θα διερευνηθεί η πιθανότητα χρήσης τους ως διαγνωστικά εργαλεία ή φαρμακευτικοί στόχοι στον καρκίνο και σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες.