Crystal structures of the elusive Rhizobium etli l-asparaginase reveal a peculiar active site

Rhizobium etli, a nitrogen-fixing bacterial symbiont of legume plants, encodes an essential l-asparaginase (ReAV) with no sequence homology to known enzymes with this activity. High-resolution crystal structures of ReAV show indeed a structurally distinct, dimeric enzyme, with some resemblance to glutaminases and β-lactamases. However, ReAV has no glutaminase or lactamase activity, and at pH 9 its allosteric asparaginase activity is relatively high, with Km for l-Asn at 4.2 mM and kcat of 438 s−1. The active site of ReAV, deduced from structural comparisons and confirmed by mutagenesis experiments, contains a highly specific Zn2+ binding site without a catalytic role. The extensive active site includes residues with unusual chemical properties. There are two Ser-Lys tandems, all connected through a network of H-bonds to the Zn center, and three tightly bound water molecules near Ser48, which clearly indicate the catalytic nucleophile.

Regulación de la simbiosis leguminosa-rizobio en condiciones de déficit hídrico: antioxidantes y compuestos nitrogenados

En un mundo que requiere urgentemente una agricultura más sostenible, los cultivos de leguminosas representan una importante alternativa. A nivel agroecológico, la característica más interesante de esta familia de plantas es su capacidad para llevar a cabo la fijación biológica de nitrógeno atmosférico (FBN), reduciendo los insumos de fertilizantes nitrogenados con una baja huella de carbono, lo que disminuye la contaminación ambiental y enriquece el suelo para los siguientes cultivos. Sin embargo, para optimizar el potencial de las leguminosas en un escenario donde los efectos del cambio climático conducirán a un aumento del impacto de las sequías, es preciso dilucidar los mecanismos fisiológicos y las vías de señalización molecular responsables de una mayor tolerancia de estos cultivos a esta situación de estrés. La disminución de la FBN provocada por la sequía es consecuencia de una serie de mecanismos fisiológicos entre los que destacan la disminución de la disponibilidad de sustratos carbonados para los bacteroides, la inhibición de la actividad nitrogenasa debido a la acumulación de compuestos nitrogenados, el incremento de la resistencia a la difusión de oxígeno y el estado redox. Con este fin de profundizar en estos factores, en este trabajo se han evaluado diferentes mecanismos implicados en la regulación del proceso de FBN bajo estrés hídrico. Estudios previos sugieren que la cepa de Rhizobium etli CFNX713, modificada genéticamente para sobreexpresar la oxidasa bacteroidal cbb3, es más eficiente en FBN tanto en condiciones óptimas de disponibilidad de agua como en situaciones de déficit hídrico en comparación con su cepa parental. Sin embargo, se desconoce su comportamiento en una etapa de recuperación tras un periodo de déficit hídrico. Así, en el primer capítulo utilizamos esta cepa de R. etli en simbiosis con Phaseolus vulgaris y analizamos los posibles antioxidantes y solutos compatibles que pudieran estar implicados en la mayor resistencia de esta simbiosis al estrés por sequía y tras la recuperación de las plantas. Bajo estas condiciones observamos como las poliaminas, moléculas relacionadas con el mantenimiento del estado redox celular, parecen estar involucradas en el proceso de tolerancia al déficit hídrico. Ya que uno de los mecanismos de tolerancia de las plantas al estrés hídrico es la síntesis de antioxidantes, en el segundo capítulo llevamos a cabo la caracterización de la sequía de plantas de Medicago truncatula que sobreexpresan el gen VTC2, integrante de la vía de síntesis de ascorbato. Dado que en otras especies vegetales se ha descrito que plantas con mayores niveles de ascorbato son más tolerantes a estreses abióticos, en este trabajo analizamos si estas plantas sobreexpresantes presentan una mejora a nivel de la FBN en condiciones de déficit hídrico. Nuestros resultados muestran que la sobreexpresión de MtVTC2 se traduce en una mayor concentración de ácido ascórbico en los nódulos en condiciones óptimas de irrigación del cultivo, pero sin repercusiones positivas en los niveles de FBN cuando el riego es deficitario. Finalmente, en el tercer capítulo, y con el fin de analizar el papel de la inhibición de la FBN debida a la acumulación de compuestos nitrogenados, llevamos a cabo un experimento de alimentación por peciolo en plantas de soja. Por esta vía a las plantas se le suministró una solución con asparagina marcada de forma estable (Asn 15N), para poder localizar su distribución a lo largo de la planta. Estos experimentos demostraron que la aplicación de asparagina inhibió la actividad fijadora a los dos días de tratamiento, alterando el metabolismo nitrogenado nodular, y provocando un desbalance en el aporte de carbohidratos de la parte aérea. Nuestros datos apoyan las hipótesis que respaldan que el estado nitrogenado de la planta es detectado mayormente en la parte aérea, provocando una acumulación de compuestos nitrogenados en el nódulo que provoca la inhibición de la FBN.

Control of the Rhizobia Nitrogen-Fixing Symbiosis by Common Bean MADS-Domain/AGL Transcription Factors

Plants MADS-domain/AGL proteins constitute a large transcription factor (TF) family that controls the development of almost every plant organ. We performed a phylogeny of (ca. 500) MADS-domain proteins from Arabidopsis and four legume species. We identified clades with Arabidopsis MADS-domain proteins known to participate in root development that grouped legume MADS-proteins with similar high expression in roots and nodules. In this work, we analyzed the role of AGL transcription factors in the common bean (Phaseolus vulgaris) – Rhizobium etli N-fixing symbiosis. Sixteen P. vulgaris AGL genes (PvAGL), out of 93 family members, are expressed – at different levels – in roots and nodules. From there, we selected the PvAGL gene denominated PvFUL-like for overexpression or silencing in composite plants, with transgenic roots and nodules, that were used for phenotypic analysis upon inoculation with Rhizobium etli. Because of sequence identity in the DNA sequence used for RNAi-FUL-like construct, roots, and nodules expressing this construct -referred to as RNAi_AGL- showed lower expression of other five PvAGL genes highly expressed in roots/nodules. Contrasting with PvFUL-like overexpressing plants, rhizobia-inoculated plants expressing the RNAi_AGL silencing construct presented affection in the generation and growth of transgenic roots from composite plants, both under non-inoculated or rhizobia-inoculated condition. Furthermore, the rhizobia-inoculated plants showed decreased rhizobial infection concomitant with the lower expression level of early symbiotic genes and increased number of small, ineffective nodules that indicate an alteration in the autoregulation of the nodulation symbiotic process. We propose that the positive effects of PvAGL TF in the rhizobia symbiotic processes result from its potential interplay with NIN, the master symbiotic TF regulator, that showed a CArG-box consensus DNA sequence recognized for DNA binding of AGL TF and presented an increased or decreased expression level in roots from non-inoculated plants transformed with OE_FUL or RNAi_AGL construct, respectively. Our work contributes to defining novel transcriptional regulators for the common bean – rhizobia N-fixing symbiosis, a relevant process for sustainable agriculture.

A Novel OmpR-Type Response Regulator Controls Multiple Stages of the Rhizobium etli – Phaseolus vulgaris N2-Fixing Symbiosis

OmpR, is one of the best characterized response regulators families, which includes transcriptional regulators with a variety of physiological roles including the control of symbiotic nitrogen fixation (SNF). The Rhizobium etli CE3 genome encodes 18 OmpR-type regulators; the function of the majority of these regulators during the SNF in common bean, remains elusive. In this work, we demonstrated that a R. etli mutant strain lacking the OmpR-type regulator RetPC57 (ΔRetPC57), formed less nodules when used as inoculum for common bean. Furthermore, we observed reduced expression level of bacterial genes involved in Nod Factors production (nodA and nodB) and of plant early-nodulation genes (NSP2, NIN, NF-YA and ENOD40), in plants inoculated with ΔRetPC57. RetPC57 also contributes to the appropriate expression of genes which products are part of the multidrug efflux pumps family (MDR). Interestingly, nodules elicited by ΔRetPC57 showed increased expression of genes relevant for Carbon/Nitrogen nodule metabolism (PEPC and GOGAT) and ΔRetPC57 bacteroids showed higher nitrogen fixation activity as well as increased expression of key genes directly involved in SNF (hfixL, fixKf, fnrN, fixN, nifA and nifH). Taken together, our data show that the previously uncharacterized regulator RetPC57 is a key player in the development of the R. etli - P. vulgaris symbiosis.

Bio-protective effect of a root-nodulating Rhizobium etli strain in common bean (Phaseolus vulgaris) against Meloidogyne incognita and Radopholus similis in an in vitro autotrophic tripartite culture system

Summary The bio-protective effect of a root-nodulating strain (CNPAF 512) of the nitrogen-fixing rhizobium, Rhizobium etli, against both a sedentary (Meloidogyne incognita) and a migratory (Radopholus similis) endoparasitic nematode in common bean (Phaseolus vulgaris) was examined using an in vitro autotrophic tripartite culture system. Two in vitro assays were carried out with each of the nematode species. Each assay consisted of two treatments: the plants were either inoculated with the rhizobial strain or remained non-inoculated (control plants). To examine the effect of either pre- or simultaneous inoculation of the rhizobial strain on the reproduction of M. incognita and R. similis, one assay was carried out in which the nematodes were inoculated 3 weeks after rhizobial inoculation while another assay was carried out in which the nematodes were inoculated simultaneously with the rihizobial strain. Both pre-inoculation and simultaneous inoculation with R. etli CNPAF 512 significantly suppressed the reproduction of both M. incognita and R. similis.

Interacción entre el hongo endofítico Fusarium oxysporum cepa 162 y la bacteria endofítica Rhizobium etli cepa G12

Las cepas de Fusarium no patogénicas son importantes para la producción de cultivos, ya que algunos de ellos han mostrado un efecto de inducción de resistencia en las plantas colonizadas, predisponiendo el sistema inmune de las plantas a defenderse contra el ataque de plagas y enfermedades. Las bacterias endofíticas son aisladas de los tejidos internos de las plantas, siendo un grupo importante las rhizobacterias. Estudios han demostrado que la inoculación de estas bacterias en diferentes cultivos disminuyó la intensidad de enfermedades causadas por patógenos del suelo, resultando en la promoción de crecimiento y salud de las plantas. Sin embargo, la variabilidad en el nivel de control biológico de las plagas y enfermedades, asociadas a la aplicación simultanea de microorganismos endofíticos, es considerado como un factor limitante al usar agentes antagonistas para la protección de cultivos. En este contexto, la presente investigación evaluó la interacción entre los endofíticos Fusarium oxysporum Fo162 y Rizobium etli G12 al aplicarlos simultáneamente en experimentos in vitro e in vivo. Los resultados indicaron que la bacteria causó una reducción significativa en el crecimiento radial del hongo, así como en su capacidad de colonización radicular. Lo anterior, sugiere que es necesario evaluar la compatibilidad entre microorganismos benéficos, antes de utilizarlos en inoculaciones simultaneas como parte de una estrategia de control biológico.