Cellular feasibility study of Acutodesmus obliquus

The development and validation of efficient microalgae conservation methods is essential for the establishment and constitution of long-term culture collections, as well as for programming for breeding and possible genetic modification of algae. However, each species of microalgae demonstrates responses considered unpredictable, and thus, making it difficult to standardize universal methods so far. The results presented in this study indicate time as a limiting factor for the conservation of A. obliquus, in the methods of conservation by refrigeration, freezing and freezing with the use of cryoprotectants, such as DMSO, Gli and Poly. Freezing with the use of cryoprotective substances demonstrated satisfactory efficiency in the conservation of microalgae, and thus, surprisingly, in conservation by refrigeration. As already known, conservation by freezing only showed low efficiency, since the cells are broken by the formation of ice crystals in their interior, and thus, making the microalgae conservation unfeasible for a longer period. The study effectively showed the conservation of A. obliquus by refrigeration and freezing with the use of cryoprotective substances mentioned in this work.

Hormonal response of Acutodesmus obliquus exposed to combined treatment with 24-epibrassinolide and lead

Phytohormones play key roles in many aspects of plant growth and development, as well as in resistance to abiotic stresses. The presence of heavy metal limits phytohormone endogenous level; however, the application of brassinosteroids (BRs) restores phytohormone homeostasis and reduces unfavorable consequences of heavy metal on plant growth. Therefore, the aim of this study was to (1) broaden previously published analyses/findings to study the effect of 24-epibrassinolide (EBL) and/or lead (Pb) on Acutodesmus obliquus phytohormone level after 5 days of cultivation using LC-QToF-MS quantification technique and (2) extend the total amount of quantified phytohormones in A. obliquus. The study confirmed that exogenous EBL increased the contents of gibberellin A3 (GA3), auxins (AXs) (indole-3-acetic acid, phenylacetic acid), BRs brassinolide, 24-epibrassinolide (EBL), 28-homobrassinolide, castasterone, 24-epicastasterone, typhasterol, cathasterone, 6-deoxotyphasterol, as well as different types of cytokinins (CKs): free bases, ribosides, and conjugates (N- and O-glucosides). On the other hand, treatment with Pb had an opposite effect on BRs, GA3, AXs, and free bases, as well as ribosides of CKs. The abscisic acid (ABA) level decreased under EBL treatment but increased in response to Pb stress. The level of N-glucosides, as well as O-glucosides of CKs, also significantly increased in response to Pb alone. Interestingly, the co-application of EBL and Pb led to an increase in BRs, GA3, AXs, and CKs content in the algae. Principal component analysis revealed that based on treatments, increase of GA3, BRs, and AXs was found to be in the following order: 1 μM EBL > 0.01 μM Pb + 1 μM EBL > 500 μM Pb + 1 μM EBL > control > 0.01 μM Pb > 500 μM Pb. Moreover, very strong significant linear relations between almost all studied AXs and BRs were noted. Summarizing, this research did not only allow to detect the occurrence of ABA, GA3, AXs, BRs, and CKs in A. obliquus for the first time but also to study the combined action of EBL and Pb, as well as compare it with treatment alone.

24-Epibrassinolide modulates primary metabolites, antioxidants, and phytochelatins in Acutodesmus obliquus exposed to lead stress

Aquatic organisms are exposed to many stressors, e.g., heavy metals. Brassinosteroids, a plant hormone group, can effectively stimulate plants to defend against the negative impact of a heavy metal. The present study was conducted with an aim to find out the influence of 24-epibrassinolide (EBL) on Acutodesmus obliquus treated with 0.01 and 500 μM of lead (Pb) ions during 7 days of cultivation. Pb has a toxic effect on algal cultures because it limits both the growth and development and induces oxidative stress. Simultaneously, 1 μM EBL was involved in protecting algal cells against the toxic effect of Pb. Despite the presence of Pb, EBL significantly increased the number of algal cells and their metabolite content (e.g., proteins, monosaccharides, chlorophylls, carotenes, and xanthophylls). Cultures treated concurrently with EBL and Pb were characterized by a reduction in their content of endogenous Pb, H2O2, and malondialdehyde. Also, EBL increased the activity of catalase, ascorbate peroxidase, superoxide dismutase, glutathione reductase, and the content of ascorbate and glutathione. EBL increased the phytochelatin synthase activity, thereby enhancing the production of phytochelatins accountable for both binding and detoxification of Pb. These results indicate the influence of EBL on the inhibitory effect of Pb in A. obliquus. These findings help to clarify the role of BRs in the algal adaptation to the prevailing stressful conditions.

Βιοεξυγίανση και αξιοποίηση αναερόβια επεξεργασμένων αγροτο-κτηνοτροφικών και αστικών οργανικών αποβλήτων για την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας με τη χρήση μικροφυκών

Η καλλιέργεια μικροφυκών στις απορροές των μονάδων παραγωγής βιοαερίου αποτελεί μία καινοτόμο και υποσχόμενη εναλλακτική διαχείρισης του υγρού κλάσματος των χωνευμένων υπολειμμάτων, επιτυγχάνοντας αποτελεσματική απομάκρυνση οργανικών και ανόργανων συστατικών, παράγοντας πολύτιμη βιομάζα για την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων και μειώνοντας σημαντικά το κόστος της καλλιέργειας. Ωστόσο, το σκούρο χρώμα και η θολερότητα των απορροών, η τοξική συγκέντρωση αμμωνίας, η έλλειψη απαραίτητων θρεπτικών συστατικών και η παρουσία παρεμποδιστών, αποτελούν προκλήσεις για την εφαρμογή της τεχνολογίας, καθιστώντας απαραίτητη την ανάπτυξη στρατηγικών βελτιστοποίησης της διεργασίας. Στο πλαίσιο αυτό, στόχος της παρούσας Διατριβής ήταν η επεξεργασία χωνευμένων αγροτο-κτηνοτροφικών και αστικών οργανικών αποβλήτων μέσω της χρήσης μικροφυκών και η αξιοποίησή τους για την παραγωγή πολύτιμων βιο-προϊόντων. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν δύο τύποι αναερόβιων απορροών, εννέα είδη μικροφυκών και αξιολογήθηκαν διαφορετικοί παράγοντες και συνθήκες καλλιέργειας, καθώς και δυνατότητες αξιοποίησης της παραγόμενης βιομάζας. Αρχικά, διερευνήθηκε η εφαρμογή διαφορετικών συγκεντρώσεων, 0.5-50% (v/v) αναερόβια χωνευμένων αγροτο-κτηνοτροφικών αποβλήτων και αξιολογήθηκε η απόδοση των μικροφυκών ως προς την παραγωγή βιομάζας και τη μέγιστη φωτοχημική απόδοση του φωτοσυστήματος (PSII). Ακολούθως, τα είδη Parachlorella kessleri και Acutodesmus obliquus καλλιεργήθηκαν σε 2% και 10% (v/v) φόρτιση σε αποστειρωμένες και μη- συνθήκες. Η συγκέντρωση 10% (v/v) αναερόβιας απορροής παρεμπόδισε την ανάπτυξη των ειδών P. kessleri και A. obliquus για 9-12 ημέρες, πέραν των οποίων παρατηρήθηκε συγκέντρωση βιομάζας 1.1 και 1 g L-1, συσσώρευση λιπαρών οξέων (FAs) 22.7 και 19.5% (w/w), κατανάλωση 49.7 και 32.3 mg L-1 αμμωνιακού αζώτου (ΝΗ3-Ν) και απομάκρυνση 84.2 και 84% ολικού φωσφόρου (ΤΡ), αντίστοιχα. Μεταξύ των δύο μικροφυκών, η απόδοση του είδους P. kessleri ήταν μεγαλύτερη ενώ δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ αποστειρωμένης και μη-αποστειρωμένης απορροής. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της απόδοσης επτά επιπλέον ειδών μικροφυκών, με στόχο την επιλογή των καταλληλότερων για την βιοτεχνολογική αξιοποίηση των απορροών. Ταυτόχρονα, η ανάλυση της ταχείας επαγωγής του φθορισμού της χλωροφύλλης αξιοποιήθηκε για πρώτη φορά ως εργαλείο επιλογής ειδών που αναπτύσσονται σε χωνευμένα απόβλητα. Πέραν των ειδών P. kessleri και A. obliquus, τα μικροφύκη Chlorella vulgaris και Tetraselmis tetrathele προσαρμόστηκαν επιτυχώς στις επικρατούσες συνθήκες, με την παραγωγή βιομάζας και τον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (μmax) να κυμαίνονται μεταξύ 570-1117 mg L-1 και 0.161-0.181 d-1, αντίστοιχα. Στην περίπτωση του είδους P. kessleri παρατηρήθηκε μικρή μόνο μεταβολή στην κατάσταση της φωτοσυνθετικής συσκευής, ενώ οι φωτοσυνθετικές παράμετροι φRo και PIABS επηρεάστηκαν σημαντικά στα είδη που δεν αναπτύχθηκαν στα χωνευμένα υπολείμματα. Η σύσταση της παραγόμενης βιομάζας των ειδών P. kessleri, A. obliquus, C. vulgaris και T. tetrathele σε λιπίδια ήταν 23.8%, 12.1%, 24.5% και 3.9%, αντίστοιχα, με κυριότερα FAs τα ελαϊκό (C18:1), παλμιτικό (C16:0) και λινολενικό (C18:3n3 ή ω-3) οξύ. Επιπλέον, και στις τέσσερις περιπτώσεις παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης απομάκρυνση NH3-N, ωστόσο η αφομοίωση του αζώτου ήταν σημαντικά χαμηλότερη, με τιμές μεταξύ 4.89-15.03%. Στη συνέχεια, τα αποδοτικότερα είδη αναπτύχθηκαν σε φωτο-βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου, ενώ ταυτόχρονα έγινε προσπάθεια αύξησης της απόδοσης των καλλιεργειών και μείωσης των απαιτήσεων νερού, μέσω της προσθήκης οργανικού άνθρακα, απαραίτητων μακρο- και μικρο- συστατικών ή υγρών αποβλήτων. Η προσθήκη τυρογάλακτος (CW) στην καλλιέργεια του είδους P. kessleri είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη συγκέντρωση βιομάζας, 2.68 g L-1 εντός 18 ημερών. Η συγκέντρωση χλωροφύλλης μειώθηκε σημαντικά παρουσία 5 g L-1 γλυκόζης, ενώ η προσθήκη MgSO4 διατήρησε τα επίπεδα χρωστικών της καλλιέργειας. Όσον αφορά στη συσσώρευση λιπιδίων, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης οργανικού άνθρακα, το ποσοστό των FAs μειώθηκε σημαντικά και το κλάσμα των κορεσμένων FAs αυξήθηκε έναντι των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs). Παράλληλα, αναπτύχθηκε ένα μαθηματικό μοντέλο για την περιγραφή της συμπεριφοράς του είδους P. kessleri σε αναερόβια χωνευμένα αγροτο-κτηνοτροφικά απόβλητα, όπου περιοριστικός παράγοντας για την ανάπτυξη θεωρήθηκε το φως, βρίσκοντας εφαρμογή σε διαφορετικές διατάξεις αλλά και αποστειρωμένες και μη- συνθήκες, με μεγάλη ικανότητα πρόβλεψης της παραγωγής βιομάζας και της απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών Ν και P. Επιπλέον, κατά την καλλιέργεια του βιομηχανικού είδους C. vulgaris, η προσθήκη 15% (v/v) CW σε 10% χωνευμένα αγροτο-κτηνοτροφικά απόβλητα αύξησε τόσο τον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (μmax) όσο και την παραγωγή βιομάζας σε 0.84 d-1 και 1.63 g L-1, αντίστοιχα. Παρόλα αυτά, δεν κατέστη εφικτή η περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης της αναερόβιας απορροής, καθώς αυξανομένης της συγκέντρωσης του χωνευμένου υπολείμματος παρατηρήθηκε μείωση του μmax, αύξηση της συγκέντρωσης των ετερότροφων μικροοργανισμών και πλήρης παρεμπόδιση της ανάπτυξης σε συγκέντρωση απορροής 80% (v/v). Αντίθετα, η αναερόβια απορροή αστικών οργανικών αποβλήτων αξιοποιήθηκε σε ποσοστό 100%, οδηγώντας σε συγκέντρωση μικροφυκών 1.24 g L-1. Ταυτόχρονα, διερευνήθηκαν οι πιθανές χρήσεις και εφαρμογές της παραγόμενης βιομάζας, συμπεριλαμβανομένων της παραγωγής βιοκαυσίμων, κυρίως βιοντίζελ και βιοαιθανόλης, συμπληρωμάτων ζωοτροφών, αντιοξειδωτικών και αντιμικροβιακών παραγόντων, οι οποίοι ελέγχθηκαν ως προς την πιθανή αναστολή της ανάπτυξης των παθογόνων βακτηρίων, Escherichia coli και Bacillus subtilis. Η σύσταση της παραγόμενης βιομάζας καθορίστηκε τόσο από τις συνθήκες καλλιέργειας όσο και τον τύπο της απορροής, με υψηλότερα ποσοστά τις πρωτεΐνες και τους υδατάνθρακες. Αντίθετα, η ανεπαρκής κατανάλωση των θρεπτικών συστατικών δεν ευνόησε τη συσσώρευση λιπιδίων, εντούτοις η υψηλή περιεκτικότητά τους σε PUFAs καθιστά το εν λόγω κλάσμα πολύτιμο. Τέλος, εκχυλίσματα του είδους C. vulgaris ανέστειλαν την ανάπτυξη του παθογόνου βακτηρίου B. subtilis, με τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) μεταξύ 0.3-2.85 mg mL-1.