Transcriptional regulation of congocidine (netropsin) biosynthesis and resistance.

The production of specialized metabolites by Streptomyces bacteria is usually temporally regulated. This regulation is complex and frequently involves both global and pathway-specific mechanisms. Streptomyces ambofaciens ATCC23877 produces several specialized metabolites, including spiramycins, stambomycins, kinamycins and congocidine. The production of the first three molecules has been shown to be controlled by one or several cluster-situated transcriptional regulators. However, nothing is known regarding the regulation of congocidine biosynthesis. Congocidine (netropsin) belongs to the family of pyrrolamide metabolites, which also includes distamycin and anthelvencins. Most pyrrolamides bind into the minor groove of DNA, specifically in A/T-rich regions, which gives them numerous biological activities, such as antimicrobial and antitumoral activities. We previously reported the characterization of the pyrrolamide biosynthetic gene clusters of congocidine ( cgc ) in S. ambofaciens ATCC23877, distamycin ( dst ) in Streptomyces netropsis DSM40846 and anthelvencins ( ant ) in Streptomyces venezuelae ATCC14583. The three gene clusters contain a gene encoding a putative transcriptional regulator, cgc1 , dst1 and ant1 respectively. Cgc1, Dst1 and Ant1 present a high percentage of amino acid sequence similarity. We demonstrate here that Cgc1, an atypical orphan response regulator, activates the transcription of all cgc genes in the stationary phase of S. ambofaciens growth. We also show that the cgc cluster is constituted of eight main transcriptional units. Finally, we show that congocidine induces the expression of the transcriptional regulator Cgc1 and of the operon containing the resistance genes ( cgc20 and cgc21 , coding for an ABC transporter), and propose a model for the transcriptional regulation of the cgc gene cluster. Importance Understanding the mechanisms of regulation of specialized metabolite production can have important implications both at the level of specialized metabolism study (expression of silent gene clusters) and the biotechnological level (increase of the production of a metabolite of interest). We report here a study on the regulation of the biosynthesis of a metabolite from the pyrrolamide family, congocidine. We show that congocidine biosynthesis and resistance is controlled by Cgc1, a cluster-situated regulator. As the gene clusters directing the biosynthesis of the pyrrolamides distamycin and anthelvencin encode a homolog of Cgc1, our findings may be relevant for the biosynthesis of other pyrrolamides. In addition, our results reveal a new type of feed-forward induction mechanism, in which congocidine induces its own biosynthesis through the induction of the transcription of cgc1 .

Dynamics of the compartmentalized Streptomyces chromosome during metabolic differentiation

Bacteria of the genus Streptomyces are prolific producers of specialized metabolites, including antibiotics. The linear chromosome includes a central region harboring core genes, as well as extremities enriched in specialized metabolite biosynthetic gene clusters. Here, we show that chromosome structure in Streptomyces ambofaciens correlates with genetic compartmentalization during exponential phase. Conserved, large and highly transcribed genes form boundaries that segment the central part of the chromosome into domains, whereas the terminal ends tend to be transcriptionally quiescent compartments with different structural features. The onset of metabolic differentiation is accompanied by a rearrangement of chromosome architecture, from a rather ‘open’ to a ‘closed’ conformation, in which highly expressed specialized metabolite biosynthetic genes form new boundaries. Thus, our results indicate that the linear chromosome of S. ambofaciens is partitioned into structurally distinct entities, suggesting a link between chromosome folding, gene expression and genome evolution.

Interplay between Non-Coding RNA Transcription, Stringent/Relaxed Phenotype and Antibiotic Production in Streptomyces ambofaciens

While in recent years the key role of non-coding RNAs (ncRNAs) in the regulation of gene expression has become increasingly evident, their interaction with the global regulatory circuits is still obscure. Here we analyzed the structure and organization of the transcriptome of Streptomyces ambofaciens, the producer of spiramycin. We identified ncRNAs including 45 small-RNAs (sRNAs) and 119 antisense-RNAs (asRNAs I) that appear transcribed from dedicated promoters. Some sRNAs and asRNAs are unprecedented in Streptomyces and were predicted to target mRNAs encoding proteins involved in transcription, translation, ribosomal structure and biogenesis, and regulation of morphological and biochemical differentiation. We then compared ncRNA expression in three strains: (i) the wild-type strain; (ii) an isogenic pirA-defective mutant with central carbon metabolism imbalance, “relaxed” phenotype, and repression of antibiotic production; and (iii) a pirA-derivative strain harboring a “stringent” RNA polymerase that suppresses pirA-associated phenotypes. Data indicated that the expression of most ncRNAs was correlated to the stringent/relaxed phenotype suggesting novel effector mechanisms of the stringent response.

The ant Lasius niger is a new source of bacterial enzymes with biotechnological potential for bleaching dye

Industrial synthetic dyes cause health and environmental problems. This work describes the isolation of 84 bacterial strains from the midgut of the Lasius niger ant and the evaluation of their potential application in dye bioremediation. Strains were identified and classified as judged by rRNA 16S. The most abundant isolates were found to belong to Actinobacteria (49%) and Firmicutes (47.2%). We analyzed the content in laccase, azoreductase and peroxidase activities and their ability to degrade three known dyes (azo, thiazine and anthraquinone) with different chemical structures. Strain Ln26 (identified as Brevibacterium permense) strongly decolorized the three dyes tested at different conditions. Strain Ln78 (Streptomyces ambofaciens) exhibited a high level of activity in the presence of Toluidine Blue (TB). It was determined that 8.5 was the optimal pH for these two strains, the optimal temperature conditions ranged between 22 and 37 °C, and acidic pHs and temperatures around 50 °C caused enzyme inactivation. Finally, the genome of the most promising candidate (Ln26, approximately 4.2 Mb in size) was sequenced. Genes coding for two DyP-type peroxidases, one laccase and one azoreductase were identified and account for the ability of this strain to effectively oxidize a variety of dyes with different chemical structures.

Isolation and identification of metabolites from marine-derived actinobacteria

Συστηματικές μελέτες που έχουν εστιάσει κατά κύριο λόγο σε βακτήρια που προέρχονται από το έδαφος έχουν καταδείξει τους μικροοργανισμούς σαν μία από τις πλουσιότερες πηγές βιοδραστικών μεταβολιτών με ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά και σημαντική φαρμακολογική δράση. Πολλοί μεταβολίτες μικροβιακής προέλευσης έχουν επιδείξει σημαντικά επίπεδα δραστικότητας σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμασιών, μεταξύ των οποίων είναι η αντιβακτηριακή, αντιμυκητιακή, αντιιική και αντικαρκινική δράση. Χρησιμοποιούνται ευρέως σαν θεραπευτικοί παράγοντες στην ιατρική, κτηνιατρική, σαν αγροχημικά και πολύ συχνά αποτελούν μόρια-οδηγούς για την σύνθεση ή ημισύνθεση ανάλογων χημικών μορίων. Οι θαλάσσιας προέλευσης μικροοργανισμοί αντιπροσωπεύουν μια ιδιαίτερη και παράλληλα ελάχιστα μελετημένη πηγή βιοδραστικών μεταβολιτών. Μεταξύ των θαλάσσιας προέλευσης μικροοργανισμών, τα ακτινοβακτήρια εμφανίζονται ως τα πλέον παραγωγικά όσο αφορά την βιοσύνθεση βιοδραστικών μεταβολιτών με πρωτότυπες χημικές δομές. Στελέχη αυτής της ταξινομικής ομάδας συχνά απαντώνται και στο έδαφος και έχουν παρουσιάσει εξαιρετική ικανότητα παραγωγής κλινικά σημαντικών αντιβιοτικών ουσιών. Καθώς το θαλάσσιο περιβάλλον είναι σημαντικά διαφοροποιημένο από το χερσαίο είναι αναμενόμενο τα θαλάσσιας προέλευσης ακτινοβακτήρια να παράγουν βιοδραστικά μόρια με ιδιαίτερες χημικές δομές. Στα πλαίσια της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής, ένας αριθμός από βακτηριακά στελέχη θαλάσσιας προέλευσης, από την τράπεζα στελεχών του Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών καλλιεργήθηκε σε μικρής κλίμακας υγρές καλλιέργειες και τα οργανικά εκχυλίσματα που προέκυψαν αξιολογήθηκαν ως προς το χημικό τους προφίλ με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). Μεταξύ αυτών, το στέλεχος BI0048, το οποίο είχε απομονωθεί ως ενδοφυτικό βακτήριο από το ροδοφύκος Laurencia glandulifera, εμφάνισε το πλέον ενδιαφέρον χημικό προφίλ και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Το ενδοφυτικό αυτό στέλεχος, το οποίο ταυτοποιήθηκε ως Streptomyces ambofaciens, καλλιεργήθηκε σε μεγάλη κλίμακα σε κωνικές φιάλες με θρεπτικό μέσο βασισμένο σε θαλασσινό νερό. Οι καλλιέργειες επωάσθηκαν στους 37 °C για 8 ημέρες με τις κωνικές φιάλες σε σταθερή ανάδευση 130 rpm επί κινούμενης τράπεζας. Μετά το πέρας της καλλιέργειας, προστέθηκε σε κάθε κωνική φιάλη ρητίνη Amberlite XAD-7HP ώστε να προσροφήσει τους εξωκυτταρικούς μεταβολίτες και ακολούθως το θρεπτικό μέσο και η ρητίνη παρέμειναν υπό ανακίνηση σε χαμηλή ταχύτητα για 12 ώρες. Η ρητίνη και τα κύτταρα διηθήθηκαν από ηθμό πολλαπλών στρωμάτων γάζας και το ίζημα εκπλύθηκε με απιονισμένο νερό για την απομάκρυνση των αλάτων. Στην συνέχεια, η ρητίνη και η κυτταρική βιομάζα εκχυλίσθηκαν εξαντλητικά με ακετόνη. Η διήθηση του εκχυλίσματος και στην συνέχεια η εξάτμιση των διαλυτών υπό κενό σε θερμοκρασία μικρότερη των 40 °C απέδωσε στερεό υπόλειμμα το οποίο υποβλήθηκε σε πολλαπλούς χρωματογραφικούς διαχωρισμούς με κανονικής και αντίστροφης φάσης χρωματογραφία με υποβοήθηση κενού, χρωματογραφία στήλης βαρύτητας και HPLC που οδήγησαν στην απομόνωση ενός σημαντικού αριθμού μεταβολιτών σε καθαρή μορφή. Ο δομικός χαρακτηρισμός των απομονωμένων μεταβολιτών βασίσθηκε στην ανάλυση των φασματοσκοπικών τους δεδομένων που ελήφθησαν από Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR), Φασματομετρία Μάζας (MS), Φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR) και Φασματοσκοπία Υπεριώδους-Ορατού (UV-Vis) και την σύγκριση τους με αντίστοιχα δεδομένα δημοσιευμένων μεταβολιτών που παρουσίαζαν δομικές ομοιότητες. Συνολικά από το οργανικό εκχύλισμα του ακτινοβακτηριακού στελέχους BI0048 απομονώθηκαν 23 μεταβολίτες, μεταξύ των οποίων 10 πολυκετίδια (1-10), τέσσερεις απλοί αρωματικοί μεταβολίτες (11-14), επτά δικετοπιπεραζίνες (15-21), ένας νουκλεοσίδης (22) και ένας μεταβολίτης (23) με μεθακρυλική ομάδα. Συγκεκριμένα, τα πολυκετίδια που απομονώθηκαν ταυτοποιήθηκαν ως η εντεροσίνη (1), η οποία επίσης έχει αναφερθεί και ως βουλγαμυκίνη, η 5-δεοξυ-εντεροσίνη (2), η γαϊλουπεμικίνη D (3), η γαϊλουπεμικίνη Ε (4), η ζουμπερικίνη A (5), η ζουμπερικίνη Β (6), η γερμισιδίνη A (7), η γερμισιδίνη Β (8), η γερμισιδίνη Κ (9) και η γερμισιδίνη L (10). Εξ αυτών, τέσσερεις μεταβολίτες είναι νέα φυσικά προϊόντα (5, 6, 9 και 10). Όλα τα πολυκετίδια που απομονώθηκαν έχουν στον σκελετό τους α-πυρανικό δακτύλιο που αποτελεί σημαντικό στοιχείο του φαρμακοφόρου τμήματος πολλών φυσικών και συνθετικών βιοδραστικών μορίων. Φυσικά προϊόντα που διαθέτουν α-πυρανικό δακτύλιο συχνά διαδραματίζουν ρόλους χημικής προστασίας για τους οργανισμούς που τους παράγουν, όπως επίσης πολύ συχνά εμφανίζουν αντιβακτηριακές, αντιμυκητιακές, αντιιικές, κυτταροτοξικές, φυτοτοξικές και νευροτοξικές ιδιότητες. Οι αρωματικοί μεταβολίτες που απομονώθηκανταυτοποιήθηκαν ως το βενζοϊκό οξύ (11), το υδροκινναμικό οξύ (12), το (E)-κινναμικό οξύ (13) και η τυροσόλη (14), η οποία επίσης ονομάζεται p-υδροξυ-φαινυλο-αιθανόλη. Οι δικετοπιπεραζίνες που απομονώθηκαν ταυτοποιήθηκαν ως η cis-cyclo(L-Pro-L-Ala) (15), η cis-cyclo(L-Pro-L-Val) (16), η cis-cyclo(L-Pro-L-Leu) (17), η cis-cyclo(L-Pro-L-Ile) (18), η cis-cyclo(L-Pro-L-Phe) (19), η trans-cyclo(L-Pro-L-Phe) (20) και η cis-cyclo(L-Pro-L-Tyr) (21). Επιπλέον, ο νουκλεοσίδης που απομονώθηκε ταυτοποιήθηκε ως η αδενοσίνη (22), ενώ ο μεταβολίτης 23 περιείχε μία μεθακρυλική ομάδα. Οι μεταβολίτες 1–10 αξιολογήθηκαν ως προς την αντιβακτηριακή τους δράση έναντι του επιδημικού, ανθεκτικού στην μεθυκιλλίνη, στελέχους EMRSA-15 και του πολυανθεκτικού στελέχους SA1199B του Staphylococcus aureus, καθώς επίσης και έναντι του στελέχους NCTC-10418 της Escherichia coli. Επίσης, η κυτταροτοξική δράση των μεταβολιτών 1–10 αξιολογήθηκε έναντι των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών MCF7 (αδενοκαρκίνωμα στήθους) και A549 (καρκίνωμα πνεύμονα). Παρ’ όλα αυτά, οι μεταβολίτες 1–10 δεν επέδειξαν αξιοσημείωτη δραστικότητα σε καμία από τις δύο βιοδοκιμές.