The Role of Junctophilin Proteins in Cellular Function

Junctophilins (JPHs) comprise a family of structural proteins that connect the plasma membrane to intracellular organelles such as the endo/sarcoplasmic reticulum. Tethering of these membrane structures results in the formation of highly organized subcellular junctions that play important signaling roles in all excitable cell types. There are four JPH isoforms, expressed primarily in muscle and neuronal cell types. Each JPH protein consists of 6 'membrane occupation and recognition nexus' (MORN) motifs, a joining region connecting these to another set of 2 MORN motifs, a putative alpha-helical region, a divergent region exhibiting low homology between JPH isoforms, and a carboxy-terminal transmembrane region anchoring into the ER/SR membrane. JPH isoforms play essential roles in developing and maintaining subcellular membrane junctions. Conversely, inherited mutations in JPH2 cause hypertrophic or dilated cardiomyopathy, while trinucleotide expansions in the JPH3 gene cause Huntington Disease-Like 2. Loss of JPH1 protein levels can cause skeletal myopathy, while loss of cardiac JPH2 levels causes heart failure and atrial fibrillation, among other disease. This review will provide a comprehensive overview of the JPH gene family, phylogeny, and evolutionary analysis of JPH genes and other MORN domain proteins. JPH biogenesis, membrane tethering, and binding partners will be discussed, as well as functional roles of JPH isoforms in excitable cells. Finally, potential roles of JPH isoform deficits in human disease pathogenesis will be reviewed.

How DNA and RNA Viruses Exploit Host Chaperones to Promote Infection

To initiate infection, a virus enters a host cell typically via receptor-dependent endocytosis. It then penetrates a subcellular membrane, reaching a destination that supports transcription, translation, and replication of the viral genome. These steps lead to assembly and morphogenesis of the new viral progeny. The mature virus finally exits the host cell to begin the next infection cycle. Strikingly, viruses hijack host molecular chaperones to accomplish these distinct entry steps. Here we highlight how DNA viruses, including polyomavirus and the human papillomavirus, exploit soluble and membrane-associated chaperones to enter a cell, penetrating and escaping an intracellular membrane en route for infection. We also describe the mechanism by which RNA viruses—including flavivirus and coronavirus—co-opt cytosolic and organelle-selective chaperones to promote viral endocytosis, protein biosynthesis, replication, and assembly. These examples underscore the importance of host chaperones during virus infection, potentially revealing novel antiviral strategies to combat virus-induced diseases.

Membrane Profiling by Free Flow Electrophoresis and SWATH-MS to Characterize Subcellular Compartment Proteomes in Mesembryanthemum crystallinum

The study of subcellular membrane structure and function facilitates investigations into how biological processes are divided within the cell. However, work in this area has been hampered by the limited techniques available to fractionate the different membranes. Free Flow Electrophoresis (FFE) allows for the fractionation of membranes based on their different surface charges, a property made up primarily of their varied lipid and protein compositions. In this study, high-resolution plant membrane fractionation by FFE, combined with mass spectrometry-based proteomics, allowed the simultaneous profiling of multiple cellular membranes from the leaf tissue of the plant Mesembryanthemum crystallinum. Comparisons of the fractionated membranes’ protein profile to that of known markers for specific cellular compartments sheds light on the functions of proteins, as well as provides new evidence for multiple subcellular localization of several proteins, including those involved in lipid metabolism.

Dynamic interplay between the co-opted Fis1 mitochondrial fission protein and membrane contact site proteins in supporting tombusvirus replication

Plus-stranded RNA viruses have limited coding capacity and have to co-opt numerous pro-viral host factors to support their replication. Many of the co-opted host factors support the biogenesis of the viral replication compartments and the formation of viral replicase complexes on subverted subcellular membrane surfaces. Tomato bushy stunt virus (TBSV) exploits peroxisomal membranes, whereas the closely-related carnation Italian ringspot virus (CIRV) hijacks the outer membranes of mitochondria. How these organellar membranes can be recruited into pro-viral roles is not completely understood. Here, we show that the highly conserved Fis1 mitochondrial fission protein is co-opted by both TBSV and CIRV via direct interactions with the p33/p36 replication proteins. Deletion ofFIS1in yeast or knockdown of the homologous Fis1 in plants inhibits tombusvirus replication. Instead of the canonical function in mitochondrial fission and peroxisome division, the tethering function of Fis1 is exploited by tombusviruses to facilitate the subversion of membrane contact site (MCS) proteins and peroxisomal/mitochondrial membranes for the biogenesis of the replication compartment. We propose that the dynamic interactions of Fis1 with MCS proteins, such as the ER resident VAP tethering proteins, Sac1 PI4P phosphatase and the cytosolic OSBP-like oxysterol-binding proteins, promote the formation and facilitate the stabilization of virus-induced vMCSs, which enrich sterols within the replication compartment. We show that this novel function of Fis1 is exploited by tombusviruses to build nuclease-insensitive viral replication compartment.

Mechanisms of subcellular membrane trafficking

Οι μεταφορείς, είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες μέσω των οποίων πραγματοποιείται η διακίνηση θρεπτικών συστατικών, μορίων σηματοδοτών ή άλλων ουσιών εντός και εκτός του κυττάρου. Αυτό τις καθιστά απαραίτητα μόρια για την επικοινωνία του κυττάρου με το περιβάλλον. Τα τελευταία χρόνια, γενετικά, βιοχημικά και βιοφυσικά δεδομένα που προέρχονται από τη μελέτη αρκετών μεταφορέων, συνέβαλλαν στην κατανόηση των σχέσεων δομής λειτουργίας και των μηχανισμών αναγνώρισης και μεταφοράς υποστρώματος. Παρά τις εξελικτικές, δομικές και λειτουργικές διαφορές τους, όλοι οι μεταφορείς χρησιμοποιούν έναν κοινό μηχανισμό εναλλασσόμενης πρόσβασης, όπου μια θέση πρόσδεσης υποστρώματος εναλάσσεται μεταξύ πολλαπλών διαμορφώσεων προκειμένου να μεταφέρει ένα υπόστρωμα από τη μία πλευρά της μεμβράνης στην άλλη. Αυτός ο βασικός μηχανισμός που διεξάγεται από δυναμικές κινήσεις του κύριου διαμεμβρανικού σώματος και υποβοηθείται από την ευελιξία υδρόφιλων βρόχων, συναντάται σε διάφορες παραλλαγές, γνωστές ως rocker-switch, rocking-bundle και μηχανισμός elevator. Μία από τις μεγαλύτερες οικογένειες δευτερογενών μεταφορέων είναι η υπεροικογένεια amino acid/polyamine/organocation (APC), η οποία περιλαμβάνει μεταφορείς που λειτουργόυν ως συμμεταφορείς διαλυτής ουσίας κατιόντος και αντιμεταφορείς διαλυτών ουσιών με μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων. Η οικογένεια Nucleobase Cation Symporter 1 (NCS1) αποτελεί μία από τις πιο καλά μελετημένες υποοικογένειες της APC υπεροικογένειας, και εκπρόσωποί της συναντώνται σε προκαρυωτικούς οργανισμούς, μύκητες και μερικά φυτά. Αυτό οφείλεται στην πληθώρα γενετικών και βιοχημικών δεδομένων που αφορούν μέλη της οικογένειας σε μύκητες, καθώς και σε εκτεταμένες δομικές και βιοφυσικές μελέτες ενός βακτηριακού ομολόγου, του συμμεταφορέα υδαντοΐνης/Na+, Mhp1. Η οικογένεια NCS1 δεν έχει αντιπροσώπους στα θηλαστικά, κάτι που την καθιστά ιδανική για τη στόχευση ειδικών φαρμάκων κατά των μικροβιακών παθογόνων. Οι μεταφορείς της οικογένειας NCS1 αποτελούνται από 12 διαμεμβρανικά τμήματα (ΔΤ) με δομή α έλικας, που συνδέονται με σχετικά μικρές ενδιάμεσες αλληλουχίες και έχουν κυτταροπλασματικά αμινο και καρβοξυτελικά άκρα. Τα ΔΤ1 10 οργανώνονται σε μια δομή ανεστραμμένης επανάληψης ανά 5 (5-helix intertwined inverted repeat; 5HIRT) που ονομάζεται αλλιώς και LeuT-fold, και συναντάται σε μεταφορείς πολλών διαφορετικών οικογενειών που εμπλέκονται στη μεταφορά νευροδιαβιβαστών, σακχάρων, αμινοξέων ή φαρμάκων. Τα δύο τελευταία διαμεμβρανικά τμήματα (11 και 12) μερικών μεταφορέων που έχουν παρόμοια δομή με τον LeuT, φαίνεται να εμπλέκονται στον ολιγομερισμό, παρά στο μηχανισμό λειτουργίας τους αυτό καθαυτό. Παρόλα αυτά, δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για το δομικό ή/και λειτουργικό τους ρόλο. Μεταφορείς που ανήκουν στην οικογένεια NCS1 στους μύκητες, είναι από τους πιο καλά μελετημένους σε γενετικό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο. Δομικά μοντέλα μυκητιακών μεταφορέων NCS1 βασίζονται σε πολλές διακριτές κρυσταλλικές δομές του βακτηριακού ομολόγου Mhp1 και υποστηρίζονται από γενετικές μελέτες που προκαθόρισαν τη θέση δέσμευσης του υποστρώματος και τα πιθανά στοιχεία που δρουν σαν πύλες, καθορίζοντας την εξειδίκευση. Πιο συγκεκριμένα, ένα σημαντικό εύρημα που προέρχεται από έρευνα του εργαστηρίου μας πάνω στους μυκητιακούς μεταφορείς της NCS1 οικογένειας (τόσο σε μέλη της Fcy όσο και της Fur υποοικογένειας) είναι ότι η εξειδίκευση δεν καθορίζεται μόνο από κατάλοιπα που βρίσκονται στο σημείο πρόσδεσης του υποστρώματος (ΔΤ1, ΔΤ3, ΔΤ6 ή ΔΤ8) αλλά και από δυναμικές κινήσεις του τμήματος ΔΤ9 ΔΤ10 που δρα σαν εξωκυτταρική πύλη.Σε αυτή τη διατριβή, παρέχουμε πειραματικά και in silico δεδομένα που αποδεικνύουν ότι η ενδοκύτωση, η λειτουργία και περιέργως η εξειδίκευση του FurE, ενός μεταφορέα του Aspergillus nidulans που ανήκει στην NCS1 οικογένεια και μεταφέρει ουρακίλη-αλλαντοΐνη και ουρικό οξύ, εξαρτάται από δυναμικές αλληλεπιδράσεις των άμινο και καρβοξυτελικών άκρων μεταξύ τους και με το βασικό σώμα του μεταφορέα. Πιο συγκεκριμένα, τα καρβοξυτελικά άκρα εμπλέκονται σε ενδομοριακές δυναμικές αλληλεπιδράσεις που είναι απαραίτητες για την εκλεπτυσμένη ρύθμιση των πυλών που ελέγχουν την επιλογή των υποστρωμάτων. Πραγματοποιώντας Μοριακές Δυναμικές (ΜΔ) και αναλύσεις μεταλλαγών στο γονίδιο του μεταφορέα, υποθέσαμε ότι αυτό συμβαίνει μέσω αλληλεπιδράσεων των κυτταροπλασματικών ουρών με ενδοκυττάριες θηλιές, οι οποίες με τη σειρά τους επηρεάζουν τη διαδικασία διαλογής υποστρωμάτων μέσω των πυλών στην εξωκυττάρια πλευρά της πλασματικής μεμβράνης. Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις εξαρτώνται άμεσα από το pH. Στη συνέχεια, αξιοποιώντας τις πληροφορίες από εκτεταμένες αναλύσεις ΜΔ, πραγματοποιήσαμε συστηματική και στοχευμένη λειτουργική ανάλυση μεταλλαγών στο μόριο του μεταφορέα FurΕ, προκειμένου να χαρακτηρίσουμε το μονοπάτι μετατόπισης του υποστρώματος κατά τη διάρκεια της μετάβασής του από τις διακριτές διαμορφώσεις του. Επιπροσθέτως, παρέχουμε πειραματικά στοιχεία που δείχνουν πως η ταυτότητα των αμινοξέων που απαρτίζουν τα δύο τελευταία ΔΤ του FurE, δεν καθορίζει την κατάλυση της μεταφοράς. Ωστόσο, ένα συντηρημένο κατάλοιπο τυροσίνης είναι απολύτως απαραίτητο για τη σωστή στόχευση του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη. Στο τελευταίο μέρος αυτής της δουλειάς, συνδυάζουμε βιοφυσικές τεχνικές και υπολογιστικές μεθόδους για να καταλάβουμε σε βάθος το μηχανισμό που διέπει το λειτουργικό ρόλο των κυτταροπλασματικών άκρων στη διαλογή και μεταφορά του υποστρώματος, κάτι που φαίνεται να αντικατοπτρίζει ένα γενικότερο μηχανισμό που χαρακτηρίζει τους μεταφορείς της APC υπεροικογένειας. Το σύνολο της διατριβής αυτής, υποστηρίζει την ευρύτερη ιδέα ότι το μέγεθος των άκρων των ευκαρυωτικών μεταφορέων αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, προσδίδοντας περισσότερους διακριτούς τρόπους ρύθμισης της λειτουργίας τους.

Structural basis underlying strong interactions between ankyrins and spectrins

Ankyrins (encoded by ANK1/2/3 corresponding to Ankyrin-R/B/G or AnkR/B/G), via binding to spectrins, connect plasma membranes with actin cytoskeleton to maintain mechanical strengths and to modulate excitabilities of diverse cells such as neurons, muscle cells, and erythrocytes. Cellular and genetic evidences suggest that each isoform of ankyrins pairs with a specific β-spectrin in discrete subcellular membrane microdomains for distinct functions, though the molecular mechanisms underlying such ankyrin/β-spectrin pairings are unknown. In this study, we discover that a conserved and short extension N-terminal to the ZU5N-ZU5C-UPA tandem (exZZU) is critical for each ankyrin to bind to β-spectrins with high affinities. Structures of AnkB/G exZZU in complex with spectrin repeats13-15 of β2/β4-spectrins solved here reveal that the extension sequence of exZZU forms an additional β-strand contributing to the structural stability and enhanced affinity of each ZU5N/spectrin repeat interaction. The junction site between the extension and ZU5N is exactly the position of a splicing-mediated miniexon insertion site of AnkB/G. The complex structures further reveal that the UPA domain of exZZU directly participates in spectrin binding. Formation of the exZZU supramodule juxtaposes the ZU5N and UPA domains for simultaneous interacting with spectrin repeats 14 and 15. However, our biochemical and structural investigations indicate that the direct and strong interactions between ankyrins and β-spectrins do not appear to determine their pairing specificities. Therefore, there likely exists additional mechanism(s) for modulating functional pairings between ankyrins and β-spectrins in cells.

Insights into the Design of p97-targeting Small Molecules from Structural Studies on p97 Functional Mechanism

p97, also known as valosin-containing protein or CDC48, is a member of the AAA+ protein family that is highly conserved in eukaryotes. It binds to various cofactors in the body to perform its protein-unfolding function and participates in DNA repair, degradation of subcellular membrane proteins, and protein quality control pathways, among other processes. Its malfunction can lead to many diseases, such as inclusion body myopathy, associated with Paget’s disease of bone and/or frontotemporal dementia, amyotrophic lateral sclerosis disease, and others. In recent years, many small-molecule inhibitors have been deployed against p97, including bis (diethyldithiocarbamate)- copper and CB-5083, which entered the first phase of clinical tests but failed. One bottleneck in the design of p97 drugs is that its molecular mechanism remains unclear. This paper summarizes recent studies on the molecular mechanisms of p97, which may lead to insight into how the next generation of small molecules targeting p97 can be designed.

Numerical Computation of Signal Stimulation from Ligand-EGFR Binding During Invadopodia Formation

Invadopodia are finger-like protrusions located at subcellular membrane which can lead to cancer cell invasion. The formation of invadopodia involves several steps such as actin polymerizations, degradation of extracellular matrix which produce ligand and signal stimulation that is occurred from the binding of ligand with epidermal growth factor receptor. In this paper, a mathematical model of signal transduction is investigated. Both signal and ligand are represented by Laplace equation with Dirichlet boundary condition for each region. The cell membrane is treated as free boundary surface to separate any activity that occurred in intracellular and extracellular regions. The motion of the interface is taken as gradient of nterior signal and the cell membrane is set as zero level set function. The problem is solved numerically using finite difference scheme of upwind, interpolation and extrapolation methods. The results showed that the formation of invadopodia is formed when protrusions exist on the cell membrane.

Defining the Subcellular Distribution and Metabolic Channeling of Phosphatidylinositol

Phosphatidylinositol (PtdIns) is an essential structural component of eukaryotic membranes that also serves as the common precursor for polyphosphoinositide (PPIn) lipids. Despite the recognized importance of PPIn species for signal transduction and membrane homeostasis, there is still a limited understanding of how the dynamic regulation of PtdIns synthesis and transport contributes to the turnover of PPIn pools. To address these shortcomings, we capitalized on the substrate selectivity of a bacterial enzyme, PtdIns-specific PLC, to establish a molecular toolbox for investigations of PtdIns distribution and availability within intact cells. In addition to its presence within the ER, our results reveal low steady-state levels of PtdIns within the plasma membrane (PM) and endosomes as well as a relative enrichment of PtdIns within the cytosolic leaflets of the Golgi complex, peroxisomes, and outer mitochondrial membranes. Kinetic studies also demonstrate the requirement for sustained PtdIns supply from the ER for the maintenance of monophosphorylated PPIn species within the PM, Golgi complex, and endosomal compartments.SummaryPemberton et al. characterize a molecular toolbox for the visualization and manipulation of phosphatidylinositol (PtdIns) within intact cells. Results using these approaches define the steady-state distribution of PtdIns across subcellular membrane compartments as well as provide new insights into the relationship between PtdIns availability and polyphosphoinositide turnover.