Sensory Test and Molecular Marker Based-Selection for Aromatic Rice in the F3 Progenies

Aromatic rice is a special type of rice that highly preferred by people in Asia due to the presence of aroma. Aroma in rice is determined by 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) compound which is controlled by a recessive fgr gene. A hybridization between cv. Sintanur (aromatic rice) and PTB33 (non-aromatic, resistant to brown planthopper/BPH) has been done in order to develop aromatic rice lines that resistant to BPH. In the F2 progeny, molecular marker-based selection and bioassay for the brown planthopper resistant lines have been carried out; however selection for the aromatic trait has not been performed yet. The objective of this study was to obtain the F3 progeny’s individual with aromatic trait. Sensory test was conducted by KOH 1.7% solution, meanwhile molecular markers applied were ESP (External Antisense Primer), IFAP (Internal Fragrant Antisense Primer), INSP (Internal Non fragrant Sense Primer) and EAP (External Antisense Primer). Eighty-eight plants from two selected (SP#31 and SP#224) F3 lines progenies derived from cv. Sintanur and PTB33 have been evaluated in this study. Detection by molecular markers found seventy-five genotypes (85.23%) were homozygous recessive (aromatic rice) and one was heterozygous (non-aromatic). Eighty-five (96.59%) genotypes were aromatic as detected by sensory test alone. Seventy-two (81.82%) genotypes were categorized as aromatic rice based on sensory test and molecular markers. Due to inconsistency results from each method alone, it is advised both methods to be applied to ensure the reliability and the accuracy since aroma in rice is affected by genetic composition and environment conditions. Selected genotypes will be continued for breeding program in developing aromatic rice with improved agronomic traits.

Serological Identity of Potato Virus X (PVX) and PCR Characterization of Its Coat Protein (CP) Gene

Potato virus X (PVX) is among top ten most economically damaging plant viruses in the world and its increasing incidence is getting an alarming situation in potato crop of Pakistan. During two consecutive years (2010-11 and 2011-12), the incidence of PVX was recorded in potato fields at Rawalpindi, Islamabad, Faisalabad and Sahiwal. The samples were collected and subjected to Double Antibody Sandwiched (DAS) Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) and average incidence of PVX was determined about 16.86% (OD405nm 1.38) during 2010-11 and 27.10% (OD405nm 0.479) in 2011-12. The infectivity of the virus was assayed through mechanical inoculation on Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. rustica, Datura stramonium, Chenopodium sp. Gomphrena and Capsicum annuum producing local lesion, mosaic and mottling symptoms. Coat protein (CP) gene specific sense and antisense primer successfully amplified a 750bp fragments through Polymerase Chain Reaction (PCR) assay.

The Efficacy of Molecular Markers Analysis with Integration of Sensory Methods in Detection of Aroma in Rice

Allele Specific Amplification with four primers (External Antisense Primer, External Sense Primer, Internal Nonfragrant Sense Primer, and Internal Fragrant Antisense Primer) and sensory evaluation with leaves and grains were executed to identify aromatic rice genotypes and their F1individuals derived from different crosses of 2 Malaysian varieties with 4 popular land races and 3 advance lines. Homozygous aromatic (fgr/fgr) F1individuals demonstrated better aroma scores compared to both heterozygous nonaromatic (FGR/fgr) and homozygous nonaromatic (FGR/FGR) individuals, while, some F1individuals expressed aroma in both leaf and grain aromatic tests without possessing thefgrallele. Genotypic analysis of F1individuals for thefgrgene represented homozygous aromatic, heterozygous nonaromatic and homozygous nonaromatic genotypes in the ratio 20 : 19 : 3. Genotypic and phenotypic analysis revealed that aroma in F1individuals was successfully inherited from the parents, but either molecular analysis or sensory evaluation alone could not determine aromatic condition completely. The integration of molecular analysis with sensory methods was observed as rapid and reliable for the screening of aromatic genotypes because molecular analysis could distinguish aromatic homozygous, nonaromatic homozygous and nonaromatic heterozygous individuals, whilst the sensory method facilitated the evaluation of aroma emitted from leaf and grain during flowering to maturity stages.

Expression of Kindlins in Acute Myeloid Leukemia

Abstract 4910 The Kindlin family of intracellular proteins has recently emerged as key regulators of cellular functions and cell-matrix interactions. They comprise of three evolutionarily conserved members, kindlin-1, kindlin-2 and kindlin-3, they share considerable sequence and structural similarities. A few of study revealed that Kindlin-2 influences solid tumor cell invasion and resistance. With regard to AML, the influence of Kindlins is still unknown. To evaluate the clinical significance of Kindlin-2 in acute myeloid leukemia (AML), we investigated the expression of Kindlin-2, kindling-3 in AML cells. 1. Materials and methods K562, KG-1a, HL60, U937, Jurkat cell lines were cultured in RPMI 1640 medium, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO) at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2. Bone marrow (BM) samples were obtained from 88 patients with de novo AML from Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College (CAMS & PUMC). Samples of 9 normal donors and ITP were used as the control group. Bone marrow mononuclear cells (BMMCs) were prepared by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. Expressions of Kindlin-2, Kindlin-3 were detected by RQ-PCR. The following primers for real-time PCR were used: (a) Kindlin-2 sense primer, 5'-CCGCTCGAGCTATGCGTATCCCCGTAG-3'; (b) Kindlin-2 antisense primer, 5'-CGACGCGTCTAGCGAGGGGTTGTC-3'; (c) Kindlin-3 sense primer, 5'-CCGCTCGAGCTATGCGTATCCCCGTAG-3'; (d) Kindlin-3 antisense primer, 5'-CGACGCGTCTAGCGAGGGGTTGTC-3'; (e) GAPDH sense primer, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'; (f) GAPDH antisense primer, 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'. Analysis was performed using ABI 7500 Sequence Detection software (Applied Biosystems). The expression of Kindlin-2 and Kindlin-3 were showed as RQ value calculated through ΔΔCt method [ΔΔCt = (CtKindlin □ CtGAPDH)sample □ (CtKindlin □ CtGAPDH)calibrator]. The ΔCt (CtKindlin □ CtGAPDH) of K562 was defined as calibrator, and the RQ of calibrator was 1.000. Relationships between Kindlin-2, Kindlin-3 and the patients' clinical data were analyzed. 2. Results Expression of Kindlins in newly diagnosis AML The level of Kindlin-2 in AML (0.163±1.665) was significantly lower than that in non-AML (1.683±1.395) controls (p=0.010). No significant difference was found between the AML and controls in levels of Kindlin-3 (p=0.216). Out of the 79 patients who accepted treatment, 61 patients achieved complete remission (CR) and 18 patients were NR. Patients with higher expression of Kindlin-2 had a higher CR rate (86.8% vs 68.3%) (p=0.050). Expression of kindling 3 was unrelated to CR rate. Both of kindling-2 and kindling-3 increased after CR. This finding implicates Kindlin-2 as a potential prognostic factor of AML. Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare.

Ο ρόλος του κυτταρομεγαλοϊού (CMV) στην παθογένεια του καρκίνου του στομάχου

Ο γαστρικός καρκίνος είναι ένα νεοπλασματικό νόσημα με παγκόσμια γεωγραφική κατανομή και συχνότητα που ποικίλει ευρέως στις διάφορες περιοχές του πλανήτη. Αποτελεί τη δεύτερη πλέον συχνή αιτία θανάτου από κακοήθεια σε παγκόσμιο επίπεδο. Οι πλέον υψηλοί δείκτες συχνότητας απαντιούνται σε χώρες όπως η Ιαπωνία, η Χιλή, η Κόστα Ρίκα, η Ρωσική Ομοσπονδία και πρώην Σοβιετικές Δημοκρατίες καθώς και κάποιες περιοχές της Κίνας, ενώ οι χαμηλότεροι δείκτες καταγράφονται στις Η.Π.Α., στο Ηνωμένο Βασίλειο, στον Καναδά, στην Αυστραλία και σε κάποιες χώρες της Αφρικανικής ηπείρου.Παρά το γεγονός ότι εδώ και πολλές δεκαετίες έχει γίνει κατανοητό ότι η καρκινογένεση είναι πολυπαραγοντικό φαινόμενο, τα τελευταία μόλις χρόνια έχουν γίνει γνωστοί σε μοριακό επίπεδο κάποιοι μηχανισμοί, οι οποίοι οδηγούν στην εμφάνισή της.Στους μηχανισμούς αυτούς πιθανολογείται ότι κάποιοι ιοί ή βακτηρίδια εμπλέκονται, η δράση των οποίων, όπως φαίνεται, επηρεάζει με άμεσο ή έμμεσο τρόπο την κυτταρική ανάπτυξη και λειτουργία, με αποτέλεσμα την εμφάνιση καρκίνου. Οι ιοί οι οποίοι πιθανόν να σχετίζονται με την ανάπτυξη των νεοπλασμάτων του πεπτικού, που είναι το αντικείμενο της παρούσας μελέτης είναι οι HBV, HCV , CMV και HSV 1 , καθώς επίσης και το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (HP). Ιδιαίτερα το τελευταίο θεωρείται ότι σχετίζεται σε μεγάλο ποσοστό με την εμφάνιση του καρκίνου του στομάχου. Τα υψηλά ποσοστά ανίχνευσης εξάλλου του CMV στους ασθενείς με καρκίνο του στομάχου, θέτουν το ερώτημα του κατά πόσο και με ποιο τρόπο ο ιός αυτός μεμονωμένα ή συνεργικά με άλλους παράγοντες, όπως το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού, διαδραματίζει κάποιο ενεργό ρόλο στην ανάπτυξη της νόσου .Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε μια προσέγγιση αυτής της υπόθεσης με τη μελέτη ιστοτεμαχιδίων γαστρικού βλεννογόνου που ε- λήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο στομάχου και προκαρκινικές καταστάσεις. Συγκεκριμένα έγινε προσπάθεια ανίχνευσης του γονιδιώματος του CMV με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) επί ιστικών δειγμάτων που ελήφθησαν ενδοσκσπικά από τις βλάβες καθώς και από ενδοσκοπικά υγειείς περιοχές πλησίον και άπω των βλαβών όπως επίσης και επί ιστικών δειγμάτων γαστρικού βλεννογόνου υγιών μαρτύρων. Η μελέτη της συμπεριφοράς του CMV με τη μέθοδο PCR διενεργήθη στο Πειραματικό Ιολογικό Εργασήριο του κέντρου Ιατρικών Ερευνών "Γ.Παπανικολάου". Εκ παραλλήλου έγινε ορο- λογικός έλεγχος αντισωμάτων έναντι του CMV και καθορισμός του τίτλου αυτών καθώς και προσπάθεια συσχετισμού της νόσου με τη λοίμωξη από το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού, το κάπνισμα, την κατανάλωση αλκοόλ και το ιστορικό μακροχρόνιας λήψης μη στεροειδών αντιφλεγ- μονοδών και ασπιρινούχων φαρμάκων. Η ιστολογική εξέταση βιοπτικού υλικού από τις βλάβες, προς επιβεβαίωση της διάγνωσης, έγινε στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Νοσοκομείου "Ο Αγιος Σάββας ". Συνολικά στην έρευνα έλαβαν μέρος 160 άτομα:• 40 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα στομάχου• 40 ασθενείς με προκαρκινικές καταστάσεις στομστομάχου (πολύποδες, εντερική μεταπλασία, γαστρική ατροφία)• 80 μάρτυρεςΑπό τα συλλεχθέντα δείγματα πραγματοποιήθηκε εξαγωγή χρω- μοσωμιακού DNA. Στο εξαχθέν DNA διεξήχθησαν τα πειράματα ανίχνευσης του ιού με τη μέθοδο PCR. Για την πραγματοποίηση της μεθόδου αυτής, για τον προσδιορισμό του CMV, χρησιμοποιήθηκαν ως ε- ναρτήρια μόρια τα κάτωθι:• Sense primer : 5’ CCA AGC GGC CTC TGA TAA CCA AGC C 3’• Antisense primer: 5’ CAG CAC CAT CCT CCT CCT CCT CTG G 3’To γονιδίωμα του CMV ανιχνεύθηκε σε 11 εκ των 40 ιστικών δειγμάτων που ελήφθησαν από καρκινικό ιστό (ποσοστό 27,5%), σε 15 εκ των 40 ιστικών δειγμάτων που ελήφθησαν από προκαρκινικές βλάβες (ποσοστό 37,5%), ενώ σε κανένα ιστικό δείγμα ληφθέν από περιοχές του γαστρικού βλεννογόνου πλησίον και άπω των νεοπλασματικών και προνεοπλασματικών βλαβών καθώς και από το γαστρικό βλεννογόνο των μαρτύρων (ποσοστό 0,0%). Διεφάνη ότι υφίσταται στατιστικώς σημαντική διαφορά όσον αφορά τα ποσοστά ανίχνευσης του CMV με τη μέθοδο PCR μεταξύ μαρτύρων και ασθενών των δύο εξεταζομένων ομάδων (ρ<0,001).Όσον αφορά τα αντισώματα ορού έναντι του CMV, IgG αντισώματα ανιχνεύθησαν σε 38 από 40 ασθενείς με γαστρικό αδενοκαρκίνωμα (ποσοστό 95%), σε 37 από τους 40 ασθενείς με προκαρκινικές βλάβες (ποσοστό 92%) και σε 76 από τους 80 μάρτυρες (ποσοστό 95 %). Τα ποσοστά ανίχνευσης του IgM αντισώματος ήταν 5%, 0% και 1,3% αντίστοιχα για τις τρεις ομάδες. Ο στατιστικός έλεγχος δεν έδειξε να υφί- σταται στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ=0,697 και ρ=0,359 αντίστοιχα).Η στατιστική συσχέτιση της συνήθειας του καπνίσματος με την παρουσία γαστρικού καρκίνου και προκαρκινικών βλαβών έδειξε ότι τα άτομα της ομάδας ελέγχου παρουσίαζαν υψηλότερα ποσοστά καπνίσματος (61 από 80, ποσοστό 76,3%) σε σχέση με τα άτομα των δύο άλλων ομάδων (24 από 40, ποσοστό 60% και 21 από 40, ποσοστό 52,5% αντίστοιχα, ρ=0,022).Επίσης διεφάνη ότι τα άτομα της ομάδας ελέγχου παρουσιάζουν μεγαλύτερη συχνότητα κατανάλωσης αλκοόλ (67 από 80, ποσοστό 83,8% ) σε σχέση με τις δύο άλλες ομάδες (23 από 40, ποσοστό 57,5% για την ομάδα του καρκίνου και 22 από 40, ποσοστό 55% για την ομάδα των προκαρκινικών βλαβών, ρ<0,001 ).Η μακροχρόνια κατανάλωση μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών και σαλικυλικών φαρμάκων δεν φάνηκε να σχετίζεται στατιστικώς με την παρουσία του γαστρικού καρκίνου και των προκαρκινικών βλαβών (ρ= 0,474 ). Τέλος, όσον αφορά το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού, δεν φάνηκε να υφίσταται στατιστικώς σημαντική διαφορά ως προς το ποσοστό ανίχνευσης του μεταξύ των δύο ομάδων ασθενών (ρ=0,074).Συσχετίζοντας το ποσοστό ανίχνευσης του DNA του ιού και το ποσοστό ανίχνευσης του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού δεν διεφάνη ότι υφίσταται στατιστικώς σημαντική διαφορά αναφορικά με την ανάπτυξη αδενοκαρκινώματος και των προδρόμων αυτού βλαβών (ρ= 0,999 και ρ=0,317 αντίστοιχα).Αρνητική συσχέτιση με το αδενοκαρκίνωμα του στομάχου διεφάνη και όσον αφορά τα ποσοστά ανίχνευσης των IgG και IgM αντισωμάτων, της συνήθειας του καπνίσματος και της κατανάλωσης αλκοόλ .

Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees

The South African isolate of Black queen-cell virus (BQCV), a honey bee virus, was previously found to have an 8550 nucleotide genome excluding the poly(A) tail. Its genome contained two ORFs, a 5′-proximal ORF encoding a putative replicase protein and a 3′-proximal ORF encoding a capsid polyprotein. Long reverse transcription (RT)–PCR was used to produce infectious transcripts for BQCV and to manipulate its genome. Primers were designed for the amplification of the complete genome, the in vitro transcription of infectious RNA and PCR-directed mutagenesis. An 18-mer antisense primer was designed for RT to produce full-length single-stranded cDNA (ss cDNA). Unpurified ss cDNA from the RT reaction mixture was used directly as a template to amplify the full genome by long high-fidelity PCR. The SP6 promoter sequence was introduced into the sense primer to transcribe RNA directly from the amplicon. RNA was transcribed in vitro with and without the presence of a cap analogue and injected directly into bee pupae, which were then incubated for 8 days. In vitro transcripts were infectious but the presence of a cap analogue did not increase the amount of virus recovered. A single base mutation abolishing an EcoRI restriction site was introduced by fusion-PCR, to distinguish viral particles recovered from infectious transcripts from wild-type virus (wtBQCV). Mutant virus (mutBQCV) and wtBQCV were indistinguishable by electron microscopy and Western blot analysis. The EcoRI restriction site was present in wtBQCV and not in mutBQCV.

First Report of a Tobamovirus in Dieffenbachia and Impatiens

Tobamoviruses were detected in two ornamental plants, Dieffenbachia picta (Araceae) and Impatiens hawkeri (Balsaminaceae), from different counties in São Paulo State, Brazil. Symptoms were chlorotic spots and rings in D. picta and mosaic, blistering, and leaf deformation in I. hawkeri. Mechanical transmission from both species induced different kinds and intensities of symptoms in the same experimental hosts (Balsaminaceae, Chenopodiaceae, and Solanaceae), except Gomphrena globosa, which was infected only by the isolate from D. picta. The viruses did not infect Cucurbitaceae and Fabaceae. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay performed with extracts from infected Nicotiana tabacum ‘White Burley’ and antisera against Cucumber green mottle, mosaic, Frangipani mosaic, Odontoglossum ringspot, Ribgrass mosaic, Tobacco mosaic (TMV), Tomato mosaic, Turnip vein clearing, and Youcai mosaic viruses (genus To-bamovirus) was positive only for TMV. Furthermore, the viruses isolated from D. picta and I. hawkeri cross-reacted with their heterologous antisera. Two sense primers for regions ≍200 and 90 nt upstream of the start codon and an antisense primer ≍60 nt downstream of the terminal codon of the coat protein (CP) gene were designed for two amplification assays. Migrating fragments the same size as the reverse-transcription polymerase chain reaction products from the TMV type strain (479 and 800 bp with internal and external primers, respectively) were produced. The CP gene sequence will allow comparison and identification of the two viruses isolated from D. picta and I. hawkeri.

Rh E/e genotyping by allele-specific primer amplification

It has been shown that the Rhesus (Rh) blood group antigens are encoded by two homologous genes: the Rh D gene and the Rh CcEe gene. The Rh CcEe gene encodes different peptides: the Rh C, c, E, and e polypeptides. Only one nucleotide difference has been found between the alleles encoding the Rh E and the Rh e antigen polypeptides. It is a C-- >G transition at nucleotide position 676, which leads to an amino acid substitution from proline to alanine in the Rh e-carrying polypeptide. Here we present an allele-specific primer amplification (ASPA) method to determine the Rh E and Rh e genotypes. In one polymerase chain reaction, the sense primer had a 3′-end nucleotide specific for the cytosine at position 676 of the Rh E allele. In another reaction, a sense primer was used with a 3′-end nucleotide specific for the guanine at position 676 of the Rh e allele and the Rh D gene, whereas the antisense primer had a 3′-end nucleotide specific for the adenine at position 787 of the Rh CcEe gene. We tested DNA samples from 158 normal donors (including non-Caucasian donors and donors with rare Rh phenotypes) in these assays. There was full concordance with the results of serologic Rh E/e phenotyping. Thus, we may conclude that the ASPA approach leads to a simple and reliable method to determine the Rh E/e genotype. This can be useful in Rh E/e genotyping of fetuses and/or in cases in which no red blood cells are available for serotyping. Moreover, our results confirm the proposed association between the cytosine/guanine polymorphism at position 676 and the Rh E/e phenotype.