Phosphoinositide Recognition Sites Are Blocked by Metabolite Attachment

Membrane readers take part in trafficking and signaling processes by localizing proteins to organelle surfaces and transducing molecular information. They accomplish this by engaging phosphoinositides (PIs), a class of lipid molecules which are found in different proportions in various cellular membranes. The prototypes are the PX domains, which exhibit a range of specificities for PIs. Our meta-analysis indicates that recognition of membranes by PX domains is specifically controlled by modification of lysine and arginine residues including acetylation, hydroxyisobutyrylation, glycation, malonylation, methylation and succinylation of sidechains that normally bind headgroups of phospholipids including organelle-specific PI signals. Such metabolite-modulated residues in lipid binding elements are named MET-stops here to highlight their roles as erasers of membrane reader functions. These modifications are concentrated in the membrane binding sites of half of all 49 PX domains in the human proteome and correlate with phosphoregulatory sites, as mapped using the Membrane Optimal Docking Area (MODA) algorithm. As these motifs are mutated and modified in various cancers and the responsible enzymes serve as potential drug targets, the discovery of MET-stops as a widespread inhibitory mechanism may aid in the development of diagnostics and therapeutics aimed at the readers, writers and erasers of the PI code.

Membrane bridging by Munc13-1 is crucial for neurotransmitter release

Munc13-1 plays a crucial role in neurotransmitter release. We recently proposed that the C-terminal region encompassing the C1, C2B, MUN and C2C domains of Munc13-1 (C1C2BMUNC2C) bridges the synaptic vesicle and plasma membranes through interactions involving the C2C domain and the C1-C2B region. However, the physiological relevance of this model has not been demonstrated. Here we show that C1C2BMUNC2C bridges membranes through opposite ends of its elongated structure. Mutations in putative membrane-binding sites of the C2C domain disrupt the ability of C1C2BMUNC2C to bridge liposomes and to mediate liposome fusion in vitro. These mutations lead to corresponding disruptive effects on synaptic vesicle docking, priming, and Ca2+-triggered neurotransmitter release in mouse neurons. Remarkably, these effects include an almost complete abrogation of release by a single residue substitution in this 200 kDa protein. These results show that bridging the synaptic vesicle and plasma membranes is a central function of Munc13-1.

Διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων ανδρογόνων ορμονών με την οικογένεια των υποδοχέων του νευρικού αυξητικού παράγοντα στην ρύθμιση της αποπτωτικής δράσης τους στον καρκίνο του προστάτη του παχέως εντέρου

H κύρια ιδιότητα των καρκινικών κυττάρων είναι να πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα και να επεκτείνονται, μειώνοντας τα επίπεδα του φυσιολογικού κυτταρικού θανάτου. Η διαδικασία αυτή οδώνεται κυρίως από την δεκτικότητα του όγκου στο μικροπεριβάλλον του και την επίδραση των αυξητικών παραγόντων και των ορμονικών συστατικών. Πιο συγκεκριμένα, ο καρκίνος του προστάτη θεωρείται μια ορμονο-εξαρτώμενη ασθένεια, ενώ για τον καρκίνο του παχέος εντέρου αυτή η σχέση δεν έχει ακόμα εδραιωθεί. Πρόσφατα, έχει αποδειχτεί ότι το ανδρογόνο τεστοστερόνη ασκεί ισχυρές προ-αποπτωτικές επιδράσεις και στους δυο τύπους καρκίνων μέσω ειδικών μεμβρανικών θέσεων δέσμευσης (specific membrane binding sites). Επιπλέον, έχει πρόσφατα περιγραφεί ότι ένα άλλο ανδρογόνο, η διϋδροεπιαδροστερόνη (DHEA), μπορεί να ενεργοποιήσει τους υποδοχείς του Νευρικού Αυξητικού Παράγοντα, συγκεκριμένα τους TrkA και p75ΝΤR, στα νευρικά κύτταρα. Ο νευρικός αυξητικός παράγοντας (Nerve Growth Factor, NGF) ως νευροτροφίνη έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχει σε μεγάλο βαθμό στον πολλαπλασιασμό και στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Πρόσφατα μελετήθηκε ότι οι υποδοχείς του NGF, συγκεκριμένα ο TrkA και p75ΝΤR συμβάλλουν στον καρκίνο, ασκώντας πλειοτροπικές επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση ή στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι επιδράσεις των ανδρογόνων που αποτελούν βασικούς παράγοντες για την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη, στην ρύθμιση της απόπτωσης στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη (DU145 και LNCaP), αλλά επίσης και στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (CaCO2), εστιάζοντας στην αλληλεπίδρασή τους με τους υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα NGF, οι οποίοι επίσης εκφράζονται στα κύτταρα αυτά και διαμεσολαβούν σημαντικές δράσεις στην επιβίωση και διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι οι DHEA και NGF αναστέλλουν ισχυρά την επαγώμενη από στέρηση ορού απόπτωση, ενώ η τεστοστερόνη επάγει την κυτταρική απόπτωση παρουσία ορού σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, η αντι-αποπτωτική δράση των DHEA και NGF αναστέλλεται πλήρως, αφού προηγηθεί επώαση των κυττάρων με τεστοστερόνη. Επίσης δείξαμε ότι όλες οι καρκινικές κυτταρικές σειρές του προστάτη (DU145 και LNCaP) και παχέος εντέρου (CaCO2) εκφράζουν τους υποδοχείς του NGF, συγκεκριμένα τους ΤrkA και p75NTR, ενώ παράλληλα διαπιστώσαμε ότι η τεστοστερόνη μειώνει την έκφραση του TrkA υποδοχέα, ενώ οι DHEA και NGF αυξάνουν την έκφραση του. Η παρουσία του αναστολέα του TrkA αναστέλλει την αντι-αποπτωτική δράση των DHEA και NGF στις καρκινικές σειρές προστάτη (DU145) και παχέος εντέρου (CaCO2). Αντίθετα αποτελέσματα έχουμε με την χρήση του αναστολέα του p75NTR και συγκεκριμένα , στην καρκινική σειρά του προστάτη DU145, η αντί-αποπτωτική δράση των DHEA και NGF μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του αναστολέα, ενώ σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου CaCO2, η προστατευτική δράση των DHEA και ΝGF είναι ίδια σε σύγκριση με την απουσία του αναστολέα. Τέλος, η παρούσα μελέτη κατέδειξε ότι οι DHEA και NGF επάγουν την φωσφορυλιώση του ΤrkA υποδοχέα και την αλληλεπίδραση του υποδοχέα p75NTR με τα ενδοκυττάρια μόρια όπως οι RhoGDI και RIP2, ενώ η τεστοστερόνη δεν έδειξε καμία ικανότητα να ενεργοποιήσει κανέναν από τους υποδοχείς TrkA και p75NTR .Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας μας δείχνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των ανδρογόνων ορμονών και των νευροτροφινών σε ορμονο-εξαρτώμενους καρκινικούς όγκους ρυθμίζει βασικές παραμέτρους της επιβίωσης των κυττάρων αυτών και προσφέρει νέες γνώσεις στην παθοφυσιολογία αυτών των νεοπλασιών.

Insecticidal Activity of Bacillus thuringiensis Cry1Bh1 against Ostrinia nubilalis (Hübner) (Lepidoptera: Crambidae) and Other Lepidopteran Pests

ABSTRACTBacillus thuringiensisis an important source of insect resistance traits in commercial crops. In an effort to prolongB. thuringiensistrait durability, insect resistance management programs often include combinations of insecticidal proteins that are not cross resistant or have demonstrable differences in their site of action as a means to mitigate the development of resistant insect populations. In this report, we describe the activity spectrum of a novelB. thuringiensisCry protein, Cry1Bh1, against several lepidopteran pests, including laboratory-selectedB. thuringiensis-resistant strains ofOstrinia nubilalisandHeliothis virescensand progeny of field-evolvedB. thuringiensis-resistant strains ofPlutella xylostellaandSpodoptera frugiperda. Cry1Bh1 is active against susceptible andB. thuringiensis-resistant colonies ofO. nubilalis,P. xylostella, andH. virescensin laboratory diet-based assays, implying a lack of cross-resistance in these insects. However, Cry1Bh1 is not active against susceptible or Cry1F-resistantS. frugiperda. Further, Cry1Bh1 does not compete with Cry1Fa or Cry1Ab forO. nubilalismidgut brush border membrane binding sites. Cry1Bh1-expressing corn, while not completely resistant to insect damage, provided significantly better leaf protection against Cry1Fa-resistantO. nubilalisthan did Cry1Fa-expressing hybrid corn. The lack of cross-resistance with Cry1Ab and Cry1Fa along with independent membrane binding sites inO. nubilalismakes Cry1Bh1 a candidate to further optimize for in-plant resistance to this pest.

Multimerin 1 binds factor V and activated factor V with high affinity and inhibits thrombin generation

SummaryMultimerin 1 (MMRN1) is a polymeric, factorV (FV) binding protein that is stored in platelet and endothelial cell secretion granules but is undetectable in normal plasma. In human platelet α-granules, FV is stored complexed to MMRN1, predominantly by noncovalent binding interactions. The FV binding site for MMRN1 is located in the light chain, where it overlaps the C1 and C2 domain membrane binding sites essential for activated FV (FVa) procoagulant function. Surface plasmon resonance (SPR), circular dichroism (CD) and thrombin generation assays were used to study the binding of FV and FVa to MMRN1, and the functional consequences. FV and FVa bound MMRN1 with high affinities (KD:2 and 7 nM, respectively). FV dissociated more slowly from MMRN1 than FVa in SPR experiments, and CD analyses suggested greater conformational changes in mixtures of FV and MMRN1 than in mixtures of FV and MMRN1. SPR analyses indicated that soluble phosphatidylserine (1,2-Dicaproylsn-glycero-3-phospho-L-serine) competitively inhibited both FV-MMRN1 and FVa-MMRN1 binding. Furthermore, exogenous MMRN1 delayed and reduced thrombin generation by plasma and platelets, and it reduced thrombin generation by preformed FVa. Exogenous MMRN1 also delayed FV activation, triggered by adding tissue factor to plasma, or by adding purified thrombin or factor Xa to purified FV. The high affinity binding of FV to MMRN1 may facilitate the costorage of the two proteins in platelet α-granules. As a consequence, MMRN1 release during platelet activation may limit platelet dependent thrombin generation in vivo.

Functional and Structural Characterization of Factor Xa Dimer in Solution.

Previous studies of blood coagulation factor Xa (bovine) showed that binding of water soluble phosphatidylserine (C6PS) to factor Xa (FXa) leads to Ca2+ dependent inactive (∼1000-fold inactivation) dimer formation. We show now that human factor Xa activity is also regulated by C6PS-induced dimerization in the presence of 5 mM Ca2+ We also report that the FXa dimer is inactive: despite the fact dimerization does not block the active site; in part because it does block a substrate exosite; the dimer interface involves lysine residues that boarder the active site and exosites, and the structure of FXa in the dimer is altered relative to the monomer. We have measured initial rates of prothrombin activation (using synthetic thrombin substrate S-2238) at varying FXa and substrate concentrations to show that the kcat/Km decreased (kcat decreased significantly and Km increased slightly) with an increase in FXa dimer formation. The observed significant decrease in kcat indicates that dimerization affects the alignment of substrate with the active site, perhaps through altering substrate binding or through altering the structure of the active site. Amidolytic activity of monomeric FXa (using synthetic substrate S-2765) decreased in response to C6PS binding, while that of the dimer increased slightly. This indicates that dimerization did not block the active site but may alter its conformation. CD and mass spectrometry showed that both Ca2+ and C6PS binding alter FXa structure and that dimerization further alters structure. Acetylation of exposed lysine residues and analysis of MS patterns obtained under conditions that favor either monomer or dimer FXa revealed that the dimerization buries lysines residues 222 and 224 (chymotrypsin numbering) that boarder the active site and are in putative exocytes. We used MS data, fluorescence energy transfer data for active site labeled FXa, to model the FXa dimer structure based on a FXa monomer model (from Gla-domainless Xa X-ray structure and Gla-EGFn with Ca2+) but the requirement that known membrane binding sites or paired FXa molecules would be located in plane was failed. Our lack of success supports our other measurements suggesting that the structure of FXa in a dimer is very different from that in a monomer. Supported by grant from the NHBL (HL 072827 to BRL).