O-20 In vitro and in vivo consequences of the sepsis effect on the endothelial cell protein C receptor

2001 ◽  
Vol 12 (7) ◽  
pp. A10-A11
Author(s):  
&NA;
Keyword(s):  
Endothelial Cell ◽  
Protein C ◽  
Cell Protein

Endothelial cell protein C receptor plays an important role in protein C activation in vivo

Blood ◽  
2001 ◽  
Vol 97 (6) ◽  
pp. 1685-1688 ◽  
Author(s):  
Fletcher B. Taylor ◽  
Glenn T. Peer ◽  
Marion S. Lockhart ◽  
Gary Ferrell ◽  
Charles T. Esmon
Keyword(s):  
Monoclonal Antibody ◽  
Endothelial Cell ◽  
Protein C ◽  
Degradation Products ◽  
Activated Protein C ◽  
Vital Signs ◽  
Cell Protein ◽  
Increased Risk

Endothelial cell protein C receptor (EPCR) augments protein C activation by the thrombin-thrombomodulin complex about 5-fold in vitro. Augmentation is EPCR concentration dependent even when the EPCR concentration is in excess of the thrombomodulin. EPCR is expressed preferentially on large blood vessel endothelium, raising questions about the importance of protein C-EPCR interaction for augmenting systemic protein C activation. In these studies, this question was addressed directly by infusing thrombin into baboons in the presence or absence of a monoclonal antibody to EPCR that blocks protein C binding. Activated protein C levels were then measured directly by capturing the enzyme on a monoclonal antibody and assaying with chromogenic substrate. Blocking protein C-EPCR interaction resulted in about an 88% decrease in circulating activated protein C levels generated in response to thrombin infusion. Leukocyte changes, fibrinogen consumption, fibrin degradation products, and vital signs were similar between the animals infused with thrombin alone and those infused with thrombin and the anti-EPCR antibody. The results indicate that EPCR plays a major role in protein C activation and suggest that defects in the EPCR gene might contribute to increased risk of thrombosis.

scholarly journals Inactivation of Factor VIIa by Antithrombin In Vitro, Ex Vivo and In Vivo: Role of Tissue Factor and Endothelial Cell Protein C Receptor

PLoS ONE ◽  
2014 ◽  
Vol 9 (8) ◽  
pp. e103505 ◽  
Author(s):  
Rit Vatsyayan ◽  
Hema Kothari ◽  
Nigel Mackman ◽  
Usha R. Pendurthi ◽  
L. Vijaya Mohan Rao
Keyword(s):  
Endothelial Cell ◽  
Tissue Factor ◽  
Protein C ◽  
Factor Viia ◽  
Ex Vivo ◽  
Cell Protein

scholarly journals Factor VIIa binding to endothelial cell protein C receptor: Differences between mouse and human systems

2012 ◽  
Vol 107 (05) ◽  
pp. 951-961 ◽  
Author(s):  
Prosenjit Sen ◽  
Curtis A. Clark ◽  
Ramakrishnan Gopalakrishnan ◽  
Ulla Hedner ◽  
Charles T. Esmon ◽  
...  
Keyword(s):  
Endothelial Cell ◽  
Plasma Levels ◽  
Protein C ◽  
Factor Viia ◽  
Cell Protein ◽  
Dependent Manner ◽  
Binding Studies ◽  
High Concentrations

SummaryRecent in vitro studies have shown that the zymogen and activated form of factor (F)VII bind to endothelial cell protein C receptor (EPCR). At present, there is no evidence that FVIIa binds to EPCR on vascular endothelium in vivo in the presence of circulating protein C, a primary ligand for EPCR. The present study was carried out to investigate the interaction of murine and human ligands with murine EPCR both in vivo and in vitro. Measurement of endogenous plasma levels of FVII in wild-type, EPCR-deficient and EPCR-over expressing mice showed slightly lower levels of FVII in EPCR-over expressing mice. However, infusion of high concentrations of competing ligands, either human APCi or FVIIai, to EPCR-over expressing mice failed to increase plasma levels of mouse FVII whereas they increased the plasma levels of protein C by two- to three-fold. Examining the association of exogenously administered mouse FVIIa or human FVIIa by immunohistochemistry revealed that human, but not murine FVIIa, binds to the murine endothelium in an EPCR-dependent manner. In vitro binding studies performed using surface plasmon resonance and endothelial cells revealed that murine FVIIa binds murine EPCR negligibly. Human FVIIa binding to EPCR, particularly to mouse EPCR, is markedly enhanced by availability of Mg2+ ions. In summary, our data show that murine FVIIa binds poorly to murine EPCR, whereas human FVIIa binds efficiently to both murine and human EPCR. Our data suggest that one should consider the use of human FVIIa in mouse models to investigate the significance of FVIIa and EPCR interaction.

Endotoxin and thrombin elevate rodent endothelial cell protein C receptor mRNA levels and increase receptor shedding in vivo

Blood ◽  
2000 ◽  
Vol 95 (5) ◽  
pp. 1687-1693 ◽  
Author(s):  
Jian-Ming Gu ◽  
Yasuhiro Katsuura ◽  
Gary L. Ferrell ◽  
Paula Grammas ◽  
Charles T. Esmon
Keyword(s):  
Cell Culture ◽  
Septic Shock ◽  
Endothelial Cell ◽  
Protein C ◽  
Fold Increase ◽  
Cell Protein ◽  
Thrombin Inhibitor ◽  
Mrna Levels ◽  
Soluble Epcr

The endothelial cell protein C receptor (EPCR) facilitates protein C activation by the thrombin-thrombomodulin complex. Protein C activation has been shown to be critical to the host defense against septic shock. In cell culture, tumor necrosis factor- (TNF-) down-regulates EPCR expression, raising the possibility that EPCR might be down-regulated in septic shock. We examined EPCR mRNA and soluble EPCR levels in mice and rats challenged with lethal dose 95 levels of endotoxin. Toxic doses of TNF- failed to alter EPCR mRNA levels in mice. Rather than EPCR mRNA levels falling in response to endotoxin, as predicted from cell-culture experiments, they rose approximately 3-fold 6 hours after exposure to endotoxin before returning toward baseline levels at 24 hours after exposure. Soluble EPCR levels rose approximately 4-fold. Infusion of hirudin, a specific thrombin inhibitor, before endotoxin exposure almost completely blocked the increase in EPCR mRNA and soluble EPCR. Consistent with the idea that the responses were mediated by thrombin, thrombin infusion (5 U/kg of body weight for 3 hours) resulted in an approximately 2-fold increase in EPCR mRNA and soluble EPCR. Incubation of rat endothelial cells with thrombin or murine protease-activated receptor 1 agonist peptide resulted in a 2-fold increase in EPCR mRNA. These results indicate that thrombin plays a major role in up-regulating EPCR mRNA and shedding in vivo.

scholarly journals Endothelial cell PTP1B regulates leukocyte recruitment during allergic inflammation

2013 ◽  
Vol 304 (4) ◽  
pp. L240-L249 ◽  
Author(s):  
Sergejs Berdnikovs ◽  
Hiam Abdala-Valencia ◽  
Joan M. Cook-Mills
Keyword(s):  
Endothelial Cell ◽  
Lung Tissue ◽  
Adhesion Molecule ◽  
Tyrosine Phosphatase ◽  
Allergic Inflammation ◽  
Leukocyte Recruitment ◽  
Cell Protein ◽  
Eosinophil Recruitment

Pulmonary eosinophilia is a consistent hallmark of allergic lung inflammation. Infiltration of eosinophils into ovalbumin (OVA)-challenged lungs is dependent on the adhesion molecule vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) on endothelial cells. Ligation of VCAM-1 activates endothelial cell protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), which is required for VCAM-1-dependent leukocyte migration in vitro. To examine whether nonhematopoietic PTP1B modulates eosinophil recruitment in vivo, mice deficient in PTP1B were irradiated and received wild-type hematopoietic cells to generate chimeric PTP1B−/− mice. In response to OVA challenge, the chimeric PTP1B−/− mice had reduced eosinophilia in the lung tissue and bronchoalveolar lavage, indicating a role for PTP1B in nonhematopoietic cells during leukocyte recruitment. To determine whether endothelial cell PTP1B modulates eosinophil recruitment, mice with an inducible endothelial cell-specific PTP1B deletion (iePTP1B mice) were generated and the PTP1B deletion was induced after antigen sensitization before antigen challenge. In response to OVA challenge, the iePTP1B mice with the endothelial cell PTP1B deletion had an increased accumulation of eosinophils bound to the luminal surface of the endothelium in the lung vasculature and had a decrease in leukocyte recruitment into the lung tissue. In the iePTP1B mice, expression of adhesion molecules, cytokines, or chemokines that regulate leukocyte recruitment during inflammation was not altered, consistent with other studies that deletion of endothelial adhesion molecule signals does not alter lung cytokines and chemokines. In summary, these data suggest that VCAM-1 activation of PTP1B in the endothelium is necessary for eosinophil recruitment during allergic inflammation. Moreover, these studies provide a basis for targeting VCAM-1-dependent signaling pathways in allergy therapies.

Regulation of the human endothelial cell protein C receptor gene promoter by multiple Sp1 binding sites

Blood ◽  
2003 ◽  
Vol 101 (11) ◽  
pp. 4393-4401 ◽  
Author(s):  
James B. Rance ◽  
George A. Follows ◽  
Peter N. Cockerill ◽  
Constanze Bonifer ◽  
David A. Lane ◽  
...  
Keyword(s):  
Gene Expression ◽  
Endothelial Cells ◽  
Endothelial Cell ◽  
Binding Sites ◽  
Hepg2 Cells ◽  
Protein C ◽  
Cell Protein ◽  
Hypersensitive Site ◽  
Flanking Region

Abstract The human endothelial cell protein C receptor (hEPCR) is normally expressed by the endothelium of large blood vessels, but the molecular basis for its in vivo specificity is uncertain. In this study, DNaseI hypersensitive site mapping demonstrated the presence of a hypersensitive site in the 5′ flanking region of the hEPCR gene in endothelial cells and certain transformed cells (HeLa and U937) known to express hEPCR in vitro. Conversely, this site was only weakly hypersensitive in HepG2 cells, cells which do not express hEPCR mRNA. Functional analysis of this 5′ flanking region by in vivo dimethylsulfate footprinting in cultured endothelial cells identified multiple regions, containing high and low homology consensus Sp1 binding sequences, that were protected from methylation in endothelial cells. These sequences were not protected in HepG2 cells. Reporter gene analysis of this region in endothelial cells demonstrated the presence of promoter activity conferred by the proximal 572 bp but failed to identify a functional TATA-box. This promoter was inactive in HepG2 cells. Electrophoresis mobility shift assays using endothelial cell nuclear extracts identified Sp1 family proteins binding to sites that were protected during footprinting. Sp1 sites were identified in regions at –368, –232, –226, –201, –146, and –102 bp relative to the translation start site. With the exception of the site at –102 bp, each identified Sp1 binding site made a positive contribution to reporter gene expression, although no individual site was critically important. We conclude that transcription factor binding to Sp1 binding sites in the 5′ flanking region is critical for normal hEPCR gene expression in endothelial cells.

scholarly journals Factor VIIa binding to endothelial cell protein C receptor protects vascular barrier integrity in vivo

2014 ◽  
Vol 12 (5) ◽  
pp. 690-700 ◽  
Author(s):  
J. Sundaram ◽  
S. Keshava ◽  
R. Gopalakrishnan ◽  
C. T. Esmon ◽  
U. R. Pendurthi ◽  
...  
Keyword(s):  
Endothelial Cell ◽  
Protein C ◽  
Factor Viia ◽  
Cell Protein ◽  
Barrier Integrity ◽  
Vascular Barrier Integrity

scholarly journals Τρόπος δράσης και θεραπευτικό όφελος της ενδοϋαλοειδικής χορήγησης μεσεγχυματικών κυττάρων λιπώδους ιστού και νανοφορέων anti-VEGF σε επαγόμενο ζωικό μοντέλο φλεβικής απόφραξης του αμφιβληστροειδούς

2021 ◽  
Author(s):  
Ελένη Γούναρη
Keyword(s):  
Endothelial Cell ◽  
Umbilical Cord ◽  
Protein C ◽  
Human Umbilical Cord ◽  
Endothelial Protein C Receptor ◽  
Ki 67 ◽  
Anti Vegf

Τα τελευταία χρόνια, η χρήση αντι-αγγειογενετικών παραγόντων (anti-VEGF) έχει συμβάλλει ενεργά στη θεραπεία της απόφραξης φλέβας του αμφιβληστροειδούς (RVO) την ίδια στιγμή που πολυμερικοί νανοφορείς για ελεγχόμενη και διαρκή αποδέσμευση του φαρμάκου αναδύονται ταχύτατα. Παράλληλα τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSCs) και οι εκκρινόμενοι από αυτά παράγοντες έχουν συσχετιστεί με την προστασία των γαγγλιακών κυττάρων, περιορίζοντας τηνν εκφύλιση. Ο αναστολέας κινάσης ΜΕΚ, PD0325901, έχει εφαρμοστεί για επαγόμενη ανάπτυξη RVO μετά από ενδοϋαλοειδική χορήγηση σε κονίκλους. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα της συνδυαστικής επίδρασης MSCs προερχόμενων από το λιπώδη ιστό (ASCs) και νανοφορέων anti-VEGF με βελτιωμένες ιδιότητες σε ένα PD0325901 φαρμακευτικά επαγόμενο μοντέλο RVO. Στην in vitro προσέγγιση της μελέτης, ο αναστολέας PD0325901 χρησιμοποιήθηκε για να επάγει την έκφραση EPCR (Endothelial Protein C Receptor), ενός κοινού για την RVO δείκτη, σε πρωτογενή σειρά ενδοθηλίου HUVEC (Human Umbilical Cord Endothelial Cell). Αντίσωμα anti-VEGF ενθυλακώθηκε σε νανοσωματίδια τροποποιημένης θειολωμένης χιτοζάνης (ThioCHI) και συνδυαστικά με MSCs εφαρμόστηκαν σε καλλιέργειες προσομοίωσης RVO προς έλεγχο της απόκρισής τους στον συνδυασμό. Σκέτα νανοσωματίδια CHI και ThioCHI κατασκευάστηκαν με την τεχνική της ιονικής πηκτωματοποίησης και τα ThioCHI επιλέχτηκαν ως πολυμερική μήτρα βελτιωμένων ιδιοτήτων βιοπροσκόλλησης για την ενθυλάκωση του anti-VEGF. Πλήρης χαρακτηρισμός των παρακευασθέντων NPs έγινε με φασματοσκοπία υπερύθρου, περίθλαση ακτίνων Χ και SEM. Τα MSCs λήφθηκαν κατόπιν ενζυμικής λύσης ανθρώπινου λιπώδους ιστού που λήφθηκε κατόπιν λιπεκτομής και καλλιεργήθηκε μέχρι και το στάδιο των 5 ανακαλλιεργειών το πολύ. Μετά από έκθεση 24 ωρών της σειράς HUVEC στον αναστολέα PD0325901, η επίδραση των NPs με ενθυλακωμένο anti-VEGF(nanoThioCHI-anti-VEGF), MSCs και συνδυασμού τους αξιολογήθηκε με ποσοτικοποίηση των εκκρινόμενων ποσοτήτων EPCR και anti-VEGF σε βάθος χρόνου με δοκιμασίες ELISA.Για τις in vivo πειραματικές δοκιμές, ASCs απομονώθηκαν κατόπιν ενζυμικής λύσης λιπώδους ιστού που λήφθηκε από τη βουβωνική χώρα κονίκλου. Τα κύτταρα εκπτύχθηκαν, χαρακτηρίστηκαν και τροποποιήθηκαν γενετικά προκειμένου να εκφράζουν την πράσινη φθορίζουσα χρωστική GFP. Εικοσι-τέσσερις κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας χωρίστηκαν στις ακόλουθες τέσσερις ομάδες: Ομάδα Ι ASCs (n = 6), ομάδα ΙΙ ASCs + nanoThioCHI-anti-VEGF (n = 6), ομάδα III RVO (n = 6) και ομάδα IV ελέγχου (n = 6). Για την επαγωγή RVO οι ομάδες Ι-ΙΙΙ έλαβαν ενδοϋαλοεδικά PD0325901 στη δόση των 0.1m ml ανά οφθαλμό ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε με τον ίδιο τρόπο BSS μόνο. Δώδεκα ημέρες αργότερα τα προτεινόμενα θεραπευτικά σχήματα χορηγήθηκαν στις ομάδες I-II ενώ οι ομάδες ΙΙΙ-IV έλαβαν BSS. Δύο εβδομάδες αργότερα έγινε ευθανασία των πειραματοζώων για να προσδιοριστεί η επίδραση όσων χορηγήθηκαν. Πριν την ευθανασία έγινε κλινική και οφθαλμολογική αξιολόγηση ενώ ακολούθησε ιστολογική ανάλυση μονιμοποιημένων τομών αμφιβληστροειδούς, ELISA για ποσοτικοποίηση εκκρινόμενων παραγόντων στο περιφερικό αίμα των ζώων και το υαλοειδές υγρό και Q-PCR για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης σχετιζόμενων με την απόφραξη ή τη φλεγμονή γονιδίων. Μικρού μεγέθους παρόμοια των εμβρυϊκών βλαστοκύτταρων (VSELs) απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα των πειραματοζώων, ως σημάδι απόκρισης στη βλάβη 12 και 36 ημέρες μετά την επαγωγή ενώ χαρακτηρίστηκαν με χρώση αλκαλικής φωσφατάσης και Q-PCR για την έκφραση γονιδίων εμβρυϊκής φύσης.Τα νανοσωματίδια τροποποιημένης χιτοζάνης (nanoThioCHI) δεν παρουσίασαν κυτταροτοξική εικόνα στις κυτταροκαλλιέργειες ενώ η απελευθέρωση anti-VEGF εμφανίστηκε συνεχής για περίπου 8 ημέρες. Τα μη φυσιολογικά επαυξημένα επίπεδα EPCR που μετρήθηκαν στο in vitro μοντέλο προσομοίωσης RVO μειώθηκαν στατιστικά σημαντικά 24 και 48 ώρες μετά την έκθεση του πάσχοντος ενδοθηλίου στα nanoThioCHI-anti-VEGF και τα MSCs. Ωστόσο ο συνδυασμός τους φάνηκε να είναι περισσότερο αποδοτικός από την μεμονωμένη παρουσία του καθενός και μάλιστα σε χρονικό διάστημα 24 ωρών, συνοδευόμενος από παράλληλη μείωση των μεταγραφικών επιπέδων VEGF από τα κύτταρα. Περιορισμένο οίδημα, αιμορραγίες και αποκόλλησεις αμφιβληστροειδούς και βελτιωμένη κυτταρική οργάνωση παρατηρήθηκε στις ομάδες Ι και ΙΙ σε σύγκριση με τα παθολογικά συμπτώματα της ομάδας ΙΙΙ που παρουσίαζε εικόνα πλήρους ιστολογικής αποδιοργάνωσης συνδυασμένη με θετική χρώση ανοσοϊστοχημείας για δείκτες νεοαγγείωσης (FVIII) ή σχετιζόμενους με την απόφραξη. Σημαντική μείωση των υψηλών επιπέδων εκκρινόμενων φλεγμονωδών κυτοκινών μετρήθηκαν στο υαλοειδές υγρό των ομάδων Ι και ΙΙ, ενώ η έκφραση RVO-σχετιζόμενων γονιδίων και γονιδίων φλεγμονής μειώθηκε επίσης σημαντικά και ειδικότερα στην ομάδα ΙΙ. Θετικές χρώσεις ανοσοϊστοχημείας για δείκτες κυτταρικής αναγέννησης (ki-67, GFAP) παρατηρήθηκαν στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία. GFP+ ASCs, ικανά για διαφοροποίηση προς προγενήτορες νευρικών κυττάρων, ανιχνεύτηκαν στα κυτταρικά εναιωρήματα των ιστών της ομάδας ΙΙ, υποδεικνύοντας την πιθανή προσκόλλησή τους στην περιοχή που έχει υποστεί βλάβη. Η χρώση H&E στα κυτταρικά επιχρίσματα του περιφερικού αίματος αποκάλυψε την παρουσία κυττάρων πολύ μικρού μεγέθους με υψηλή αναλογία πυρήνα-κυτταροπλάσματος στην ομάδα RVO. Η θετική χρώση αλκαλικής φωσφατάσης σε συνδυασμό με την υπερέκφραση των γονιδίων Oct3/4, Nanog και Sox-2 επιβεβαίωσε την ύπαρξη αδιαφοροποίητων κυττάρων με εμβρυϊκά χαρακτηριστικά ως απόκριση στην επαγόμενη βλάβη. Συμπερασματικά η παρούσα διατριβή προτείνει μία θεραπεία βασισμένη στη χρήση βλαστοκυττάρων λιπώδους ιστού και συνοδευόμενη από τη διαρκή και χρονοελεγχόμενη απελευθέρωση anti-VEGF από βελτιωμένους νανοφορείς με στόχο το συνδυασμό της παρακρινούς δράσης των βλαστοκυττάρων με τον σταδιακό περιορισμό της παθολογικής νεοαγγείωσης για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της RVO.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document