Актуальность. Формирующиеся при перенасыщении крови ионами кальция и фосфора и циркулирующие в кровотоке кальций-фосфатные бионы (КФБ) вызывают дисфункцию эндотелия вследствие гибели части артериальных эндотелиальных клеток (ЭК). Цель исследования. Оценить типы гибели первичных артериальных ЭК человека под воздействием физиологических и супрафизиологических концентраций сферических КФБ (СКФБ) и игольчатых КФБ (ИКФБ). Материалы и методы. К конфлюэнтным культурам первичных ЭК коронарной и внутренней грудной артерии человека в 96-луночных планшетах были добавлены равные объемы (10 мкл на лунку) суспензий СКФБ и ИКФБ с оптической плотностью 0,08-0,10 (физиологическая концентрация) или 0,42-0,45 (супрафизиологическая концентрация) на длине волны 650 нм. Во всех экспериментальных группах также производилось селективное ингибирование каспазы-3 (Z-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK, 100 мкмоль/л) или ингибирование всех каспаз (Z-VAD(OMe)-FMK, 100 мкмоль/л) для оценки типа клеточной гибели (регулируемая или моментальная). Жизнеспособность клеток определялась посредством последовательного колориметрического определения их метаболической активности через 4, 24 и 48 часов после добавления КФБ. Результаты. При добавлении супрафизиологических концентраций КФБ уже на первой временной точке большинство (60-85%) эндотелиальных клеток погибало вне зависимости от типа добавленных КФБ и воздействия ингибиторов каспаз, при этом через 24 и 48 часов экспозиции ингибиторы каспаз оказывали некоторое цитопротективное действие на незначительное количество выживших клеток. При добавлении физиологических концентраций КФБ ингибиторы каспаз оказывали выраженное цитопротективное действие через 24 и 48 часов экспозиции, при этом ИКФБ демонстрировали существенно более высокую токсичность для ЭК в сравнении с СКФБ. Независимо от временной точки пан-каспазный ингибитор оказывал значительно более выраженное цитопротективное действие по сравнению с селективным ингибитором каспазы-3, что свидетельствует о кумулятивном эффекте ингибирования каспаз, возникающем, вероятно, вследствие запуска внутреннего пути апоптоза. Заключение. В супрафизиологических концентрациях КФБ вызывают моментальную гибель абсолютного большинства ЭК, однако в физиологических концентрациях ингибиторы каспаз существенно повышают выживаемость ЭК, что свидетельствует о регулируемом направлении их клеточной гибели. Дальнейшие исследования в этом направлении должны расшифровать молекулярные пути регулируемой клеточной гибели ЭК под воздействием физиологических концентраций КФБ.
Background. Calcium phosphate bions (CPB) formed and circulating in the blood at its supersaturation with calcium and phosphate provoke endothelial dysfunction by causing the demise of arterial endothelial cells (ECs). Aim. To examine cell death subroutines of human primary arterial ECs exposed to physiological and supraphysiological concentrations of spherical CPB (CPB-S) and needle-shaped CPB (CPB-N). Materials and methods. Equal volumes (10 μL) of CPB-S and CPB-N at physiological concentration (optical density at 650 nm wavelength = 0.08-0.10) or supraphysiological amounts (optical density at 650 nm wavelength = 0.42-0.45) were added to the confluent primary human coronary artery and internal thoracic artery ECs cultured in 96-well plates. In all experimental groups, we selectively inhibited caspase-3 by adding Z-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK (100 μmol/L) or all caspases (Z-VAD(OMe)-FMK, 100 μmol/L) to assess whether the CPB-induced cell death is regulated or accidental. Cell viability was evaluated by sequential colorimetric determination of metabolic activity at 4, 24, and 48 hours of incubation with CPB. Results. At supraphysiological CPB concentrations, the majority (60-85%) of ECs died regardless of CPB type and caspase inhibitors, albeit at 24- and 48-hour time points the latter had minor cytoprotective action. However at physiological CPB levels, caspase inhibitors rescued a considerable proportion of ECs after 24 or 48 hours of exposure, and CPB-N had significantly higher toxicity than CPB-S. Regardless of the time point, the cytoprotective effect of the pan-caspase inhibitor was significantly higher than that of the selective caspase-3 inhibitor indicating a cumulative caspase inhibition and suggesting that cell death was precipitated by an intrinsic apoptosis pathway. Conclusion. At supraphysiological concentrations, CPB cause instant cell death; yet at physiological amounts, caspase inhibitors rescue the majority of ECs testifying to the regulated cell death. Further studies in this field should decipher the molecular pathways of CPB-induced regulated cell death of ECs.
Avaliação da expressão da caspase-3 no adenocarcinoma colorretal através de um sistema computadorizado de análise de imagem
