Development of a Method to Detect Mycobacterium paratuberculosis in the Blood of Farmed Deer Using Actiphage® Rapid

Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (MAP) is the causative agent of Johne's disease, which is an economically and clinically relevant pathogen for commercial deer production. The purpose of this study was to develop a method that could be used to rapidly detect MAP infection in deer using the Actiphage Rapid blood test. This test has previously been used to detect MAP in cattle blood following the purification of buffy coat using Ficoll gradients, however this method is quite laborious and costly. The purpose of this study was to develop a simpler method of blood preparation that was also compatible with deer blood and the Actiphage test. Initially differential lysis of RBCs using Ammonium Chloride-Potassium (ACK) blood lysis buffer was compared with the Ficoll gradient centrifugation method using cattle blood samples for compatibility with the Actiphage reagents, and it was found that the simpler ACK method did not have an impact on the Actiphage test reagents, producing an equivalent sensitivity for detection of low levels of MAP. When the two methods were compared using clinical blood samples from farmed deer, the ACK lysis method resulted in a cleaner sample. When a blinded test of 132 animals from 4 different production groups was carried out, the majority of the positive test results were found to be from animals in just one group, with a small number identified in a second group. The test results were found to be reproducible when a small set of positive animals were tested again 1 month after their initial testing. Finally a set of negative animals which had been previously screened using an ELISA test, all animals gave a negative Actiphage result. This study shows that this improved sample preparation method and Actiphage blood testing can be used to test blood samples from deer, and the full diagnostic potential of the method can now be evaluated.

The genotoxic effects in the leukocytes of workers handling nanocomposite materials

The extensive development of nanotechnologies and nanomaterials poses a number of questions to toxicologists about the potential health risks of exposure to nanoparticles (NP). In this study, we analysed DNA damage in the leukocytes of 20 workers who were long-term exposed (18 ± 10 years) to NP in their working environment. Blood samples were collected in September 2016, before and after a shift, to assess (i) the chronic effects of NP on DNA (pre-shift samples) and (ii) the acute effects of exposure during the shift (the difference between pre- and post-shift samples). The samples from matched controls were taken in parallel with workers before the shift. Leukocytes were isolated from heparinised blood on a Ficoll gradient. The enzyme-modified comet assay (DNA formamido-pyrimidine-glycosylase and endonuclease III) demonstrated a considerable increase of both single- and double-strand breaks in DNA (DNA-SB) and oxidised bases when compared with the controls (2.4× and 2×, respectively). Acute exposure induced a further increase of DNA-SB. The welding and smelting of nanocomposites represented a higher genotoxic risk than milling and grinding of nanocomposite surfaces. Obesity appeared to be a factor contributing to an increased risk of oxidative damage to DNA. The data also indicated a higher susceptibility of males vs. females to NP exposure. The study was repeated in September 2017. The results exhibited similar trend, but the levels of DNA damage in the exposed subjects were lower compared to previous year. This was probably associated with lower exposure to NP in consequence of changes in nanomaterial composition and working operations. The further study involving also monitoring of personal exposures to NP is necessary to identify (i) the main aerosol components responsible for genotoxic effects in workers handling nanocomposites and (ii) the primary cause of gender differences in response to NP action.

Τεχνικές ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων σε καρκινώματα παχέος εντέρου

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTCs) είναι κύτταρα που έχουν διαφύγει από τον πρωτοπαθή όγκο και έχουν εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος. Οι μεταστάσεις είναι η κύρια αιτία θανάτου των ασθενών με συμπαγείς επιθηλιακούς κακοήθεις όγκους, που είναι ανθεκτικές στις συμβατικές θεραπείες (π.χ. Ca μαστού, παχέος εντέρου, προστάτου). Η αιματογενής διασπορά των καρκινικών κυττάρων από τον πρωτοπαθή όγκο είναι το καθοριστικό βήμα για τη δημιουργία μεταστάσεων και επιδρά σημαντικά στην πρόγνωση των ασθενών. Τα καρκινικά κύτταρα μεθίστανται και εγκαθίστανται σε διάφορα όργανα κάνοντας αδύνατη την εξάλειψη της νόσου με το χειρουργείο, τις ακτινοβολίες, τη χημειοθεραπεία ή τις βιολογικές θεραπείες. Η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων θεωρείται ότι συμβάλλει στην πρώιμη διάγνωση, στην παρακολούθηση των ασθενών, ειδικά στους ασθενείς με μετάσταση, στην ανταπόκριση στις θεραπείες, αλλά και στην επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού σχήματος και την εξατομικευμένη θεραπεία. Οι τεχνικές ανίχνευσης των CTCs μπορούν να διαχωριστούν αδρά σε κυτταρομετρικές που εξετάζουν το κύτταρο σαν ολότητα και στην κατηγορία αυτή ανήκουν η ανοσοϊστοχημεία, η κυτταρομετρία σάρωσης με laser, το σύστημα CellSearch και η κυτταρομετρία ροής και σε μοριακές τεχνικές οι οποίες βασίζονται στην ανίχνευση νουκλεϊνικών οξέων με την RT-PCR.Με δεδομένο ότι τα CTCs αποτελούν σπάνια συμβάντα (1 καρκινικό κύτταρο σε 106-107 λευκοκύτταρα) καθίσταται αναγκαίο ένα στάδιο διαχωρισμού από τα υπόλοιπα κύτταρα του αίματος, που προηγείται της ανίχνευσης. Ο διαχωρισμός των κυττάρων μπορεί να γίνει α) βάσει των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών τους, όπως πχ. το μέγεθος και την πυκνότητα του κυττάρου χρησιμοποιώντας τη βαθμίδωση πυκνότητας (ficoll gradient) ή φίλτρα και β) με τη χρήση ειδικών δεικτών για τα καρκινικά κύτταρα (ανοσοαπομόνωση) χρησιμοποιώντας ανοσομαγνητικά σφαιρίδια. Επιπλέον, η επιλογή των κυττάρων μπορεί να είναι αρνητική (μειώνοντας τα λευκοκύτταρα) οπότε χρησιμοποιείται το CD45, θετική με τη χρήση αντισωμάτων για κάποιο αντιγόνο κοινό για πολλαπλών τύπων καρκινικά κύτταρα (EpCAM) ή ειδικό για ένα συγκεκριμένο είδος όγκου.Οι μοριακές τεχνικές αποτελούν το gold standard στην ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων καθώς χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Λίγες έως τώρα μελέτες έχουν γίνει με κυτταρομετρία ροής (ΚΡ), όμως αυτό που χαρακτηρίζει την ΚΡ είναι ότι πλεονεκτεί σε ταχύτητα και απλότητα.Σκοπός της παρούσης διδακτορικής διατριβής ήταν η συγκριτική μελέτη μεθόδων ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκινώματα παχέος εντέρου, η συσχέτιση τους ως προς την ευαισθησία και ειδικότητα τους, το όριο ανίχνευσης (traceability) τους και τέλος η συμβολή μας στις προτεινόμενες βιβλιογραφικά πολυκεντρικές μελέτες για τον καθορισμό cutoff values και την επιλογή των κατάλληλων “Tumor specific” δεικτών, από την πληθώρα των επί του παρόντος χρησιμοποιούμενων.Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν 84 δείγματα από λήψεις περιφερικού αίματος ασθενών κατά τις φάσεις: 1) προ χειρουργείου και πριν την εφαρμογή αναισθησίας, και 2) την επόμενη της χειρουργικής επέμβασης, ενώ την ομάδα ελέγχου απετέλεσαν 16 ασθενείς χωρίς ένδειξη για ύπαρξη καρκινώματος παχέος εντέρου.Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μοριακές τεχνικές (PCR, Nested PCR και RT-PCR) καθώς και κυτταρομετρία ροής (ΚΡ).Η μελέτη εκπονήθηκε στο Πανεπιστημιακό Γ.Ν «ΑΤΤΙΚΟΝ», στο Εργαστήριο Διαγνωστικής Κυττταρολογίας, σε συνεργασία με την Δ’ Πανεπιστημιακή Χειρουργική Κλινική. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου «ΑΤΤΙΚΟΝ», από όπου και έχει παρθεί η σχετική έγκριση.Η στατιστική ανάλυση και επεξεργασία των δεδομένων έγινε με το στατιστικό πακέτο SPSS statistics for Windows Version: 20.0. Για ανεξάρτητα δείγματα έγινε ο στατιστικός έλεγχος t-test που αφορούσε την σύγκριση της μέσης τιμής συνεχών παραμέτρων (ηλικία, αριθμός κυττάρων) στις κατηγορίες ασθενών-υγιών μαρτύρων (ποιοτικές μεταβλητές) και για κατηγορικές μεταβλητές το Fisher’s exact test. Για την συσχέτιση δύο μεταβλητών εφαρμόστηκε ο στατιστικός έλεγχος Spearman correlation (rho). Στατιστικά σημαντικές θεωρήθηκαν διαφορές με p<0.05.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη συνοψίζονται ως εξής:Μοριακές τεχνικέςΣτατιστικά σημαντική αύξηση στα παθολογικά δείγματα αναγνωρίστηκε μόνο με την ανίχνευση των CK19 μεταγράφων (p=0.024) με την nested μέθοδο, με ασθενή συσχέτιση με το στάδιο του όγκου (Grade, p=0.012). Μεγαλύτερη ευαισθησία (SN) παρουσίασε η CK19 nested (67.6%) με ειδικότητα (SP) 66.2%. Για τις CK20 και την απλή PCR για την CK19 τα ποσοστά ήταν αρκετά χαμηλότερα (SN: 2.9%, 30.9%, SP: 100%, 75%).H ανίχνευση EGFR nested παρουσίασε SN: 22.1%, SP: 71.2%.Κυτταρομετρία ροής (ΚΡ)Οι σημαντικότερες συσχετίσεις που αναγνωρίστηκαν ήταν για την έκφραση CK με τα καρκινώματα (0.256, p=0.044), με ύπαρξη διήθησης λεμφαδένων (0.380 p=0.008) και το στάδιο της νόσου (0.391, p=0.003). Για το άμεσο πρωτόκολλο βρέθηκε σημαντική συσχέτιση με τα δείγματα από το δεξί κόλον (0.369, p=0.002) και με την θετικότητα για nested CK19 (0.241, p=0.042).H ανίχνευση με το άμεσο πρωτόκολλο παρουσίασε με όριο τα 3 κύτταρα/mL (cut off value) SN: 49.2% με SP: 58.3%, ενώ το ένδοκυττάριο με όριο τo 1 κύτταρο/mL (cut off value) SN: 62.7% με SP: 70%.Συμπερασματικά η σύγκριση μεταξύ των δύο τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μοριακών (PCR, Nested PCR και RT-PCR) και κυτταρομετρίας ροής (ΚΡ), κατέδειξε τη δυναμική υπεροχή της κυτταρομετρίας ροής, χωρίς ωστόσο να μειώνεται η αξία των μοριακών τεχνικών και ειδικότερα η εισαγωγή και χρήση πλέον σήμερα στα σύγχρονα εργαστήρια της ποσοτικής PCR (qPCR) και της πραγματικού χρόνου ποσοτικής PCR [Real‐Time Quantitative PCR (qPCR].Τέλος θα πρέπει να τονιστεί ότι τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν επιπρόσθετο προγνωστικό δείκτη για την εξέλιξη της νόσου σε νεοδιαγνωσθέντες με καρκίνο ασθενείς και χαρακτηρίζονται ως «πραγματικού χρόνου υγρή βιοψία» (“real-time liquid biopsy”).

Production of fertile sperm from in vitro propagating enriched spermatogonial stem cells of farmed catfish, Clarias batrachus

SummarySpermatogenesis is a highly co-ordinated and complex process. In vitro propagation of spermatogonial stem cells (SSCs) could provide an avenue in which to undertake in vivo studies of spermatogenesis. Very little information is known about the SSC biology of teleosts. In this study, collagenase-treated testicular cells of farmed catfish (Clarias batrachus, popularly known as magur) were purified by Ficoll gradient centrifugation followed by magnetic activated cell sorting using Thy1.2 (CD90.2) antibody to enrich for the spermatogonial cell population. The sorted spermatogonial cells were counted and gave ~3 × 106 cells from 6 × 106 pre-sorted cells. The purified cells were cultured in vitro for >2 months in L-15 medium containing fetal bovine serum (10%), carp serum (1%) and other supplements. Microscopic observations depicted typical morphological SSC features, bearing a larger nuclear compartment (with visible perinuclear bodies) within a thin rim of cytoplasm. Cells proliferated in vitro forming clumps/colonies. mRNA expression profiling by qPCR documented that proliferating cells were Plzf + and Pou2+, indicative of stem cells. From 60 days onwards of cultivation, the self-renewing population differentiated to produce spermatids (~6 × 107 on day 75). In vitro-produced sperm (2260 sperm/SSC) were free swimming in medium and hence motile (non-progressive) in nature. Of those, 2% were capable of fertilizing and generated healthy diploid fingerlings. Our documented evidence provides the basis for producing fertile magur sperm in vitro from cultured magur SSCs. Our established techniques of SSC propagation and in vitro sperm production together should trigger future in vivo experiments towards basic and applied biology research.

Iodixanol Density Gradient Preparation in University of Wisconsin Solution for Porcine Islet Purification

Previously published as Graham, J.M. (2002) Purification of Islets of Langerhans from porcine pancreas. TheScientificWorldJOURNAL 2, 1657–1661. ISSN 1537-744X; DOI 10.1100/tsw.2002.847.Generally, prior to the purification of isolated pancreatic islets, the collagenase-digested tissue is incubated in the University of Wisconsin solution (UWS; ~320 mOsm) for osmotic stabilization to preserve or improve the density differences between islets and acinar fragments. The adverse effects arising from the subsequent pelleting and resuspension of the islets in a second, different (often highly hyperosmotic) purification solution are avoided in the protocol described here; preparation of the purification medium is simply achieved by mixing the UWS preincubated islets with a second UWS containing the inert impermeant iodixanol. Flotation of the islets isolated from juvenile porcine pancreases through this mildly hypertonic (~380 mOsm) gradient of iodixanol-UWS achieves a much higher recovery of islets of an improved viability than the customary method using a Ficoll gradient. The method has been extended to human islet purification.

Assessment of Intracellular Insulin Content during All Steps of Human Islet Isolation Procedure

This study investigated the recovery of pancreatic insulin content during human islet isolation prior to and after digestion-filtration, continuous Hanks-Ficoll gradient purification ( n = 20), and 3–4 day culture at 22°C ( n = 6). The native insulin content varied in a wide range from 28.4 U to 360.8 U/pancreas. After digestion the initially measured average insulin content of 115.8 ± 20.8 U/pancreas (mean ± SEM) increased to 264.6 ± 22.8% ( p < 0.001). This increase of insulin during pancreas digestion was attributed to the asymetrical distribution of insulin within the pancreas. Sampling of insulin within the pancreatic caput seemed not to be representative for the insulin content of the complete native organ, because the ratio of insulin per gram tissue within the pancreatic cauda compared to the caput ( n = 5) was 2.4 ± 0.4 ( p < 0.05). After purification total insulin recovery was 55.3 ± 4.8% ( p < 0.001). Because recovery of islet equivalent number (IEQ) (83.7 ± 4.4%) exceeded insulin recovery, insulin/IEQ ratio decreased from 656.8 ± 70.6 μU/IEQ before purification to 436.4 ± 58.1 μU/IEQ ( p < 0.001) after purification. After 22° C culture ( n = 6) recovery of insulin and IEQ was 80.1 ± 8.1% ( p < 0.05) and 92.8 ± 3.5% ( p = NS), respectively. Insulin content per IEQ decreased to 85.8 ± 6.5% ( p < 0.05). This study clearly shows that most of islet insulin is lost during purification. This seems to be caused rather by an amplified insulin release than by the loss of islets itself. This release may facilitate the separation of endocrine and exocrine tissue by gradient centrifugation, but may also accelerate islet exhaustion detrimental for long-term insulin independence. © 1998 Elsevier Science Inc.