Fundamentos y aplicaciones biomédicas de las principales tecnologías de secuenciación: una revisión de literatura

Introducción. La secuenciación tiene como finalidad determinar la composición de los nucleótidos presentes en el ADN o ARN. Desde la finalización del proyecto genoma humano, surgieron diversas tecnologías de secuenciación como Roche 454, SOLID, Illumina, Ion torrent, Pacbio y Oxford nanopore como herramientas para secuenciar rápidamente, con mayor precisión y costo-eficiencia, permitiendo el desarrollo de proyectos a gran escala y el estudio de genes y genomas, la composición de microbiomas, enfermedades metabólicas y enfermedades genéticas que afectan la población. Objetivo. Describir los fundamentos de los métodos de secuenciación de ADN y sus aplicaciones en las ciencias biomédicas. Métodos. Revisión descriptiva de las principales estrategias de secuenciación de ADN de primera, segunda y tercera generación y su aplicación en el entorno biomédico. Esta revisión se realizó a partir de la búsqueda de artículos en bases de datos electrónicas especializadas en investigación científica. Se encontraron 118 documentos, de los cuales se excluyeron 6 por no cumplir con los criterios de inclusión y se seleccionaron 112 por cumplir con todos los requisitos. Conclusiones. La secuenciación de ADN y ARN ha permitido avances en los estudios de organismos biológicos, el surgimiento de los métodos de secuenciación de siguiente generación arroja una gran cantidad de datos, incluidos genomas secuenciados completamente de varias especies, con un rendimiento extenso, tiempos reducidos y costo-eficiencia que lleva a la transformación por completo de las ciencias de la vida, logrando un progreso sin precedentes en el análisis de genomas, la evaluación de ecología microbiana y el diagnóstico de enfermedades.

High-Quality Draft Genome Sequence Resources of Eight Xylella fastidiosa Strains Isolated from Citrus, Coffee, Plum, and Hibiscus in South America

Xylella fastidiosa subsp. pauca, once confined to South America and infecting mainly citrus and coffee plants, has been found to be associated with other hosts and in other geographic regions. We present high-quality draft genome sequences of X. fastidiosa subsp. pauca strains J1a12, B111, U24D, and XRB isolated from citrus plants in Brazil, strain Fb7 isolated from a citrus plant in Argentina and strains 3124, Pr8x, and Hib4 isolated, respectively, from coffee, plum, and hibiscus plants in Brazil. Sequencing was performed using Roche 454-GS FLX, MiSeq-Illumina or Pacific Biosciences platforms. These high-quality genome assemblies will be useful for further studies about the genomic diversity, evolution, and biology of X. fastidiosa.

Σύσταση, δομή και οικοφυσιολογικός ρόλος μικροοργανισμικών κοινοτήτων στον πεπτικό σωλήνα εκτρεφόμενων ιχθύων

Η παρούσα Διδακτορική διατριβή, επικεντρώθηκε στη μελέτη των αυτόχθονων βακτηριακών κοινοτήτων του γαστρεντερικού συστήματος έξι (6) ειδών εκτρεφόμενων ιχθύων (Sparus aurata, Dicentrarchus labrax, Diplodus puntazzo, Pagrus pagrus, Argyrosomous regius και Salmo salar). Σκοπός αποτέλεσε η ανίχνευση παραγόντων που συνθέτουν τις γαστρεντερικές βακτηριακές τους κοινότητες (γεωγραφική θέση – απόσταση, συνθήκες εκτροφής κλπ.), την εύρεση κοινών βακτηριακών ειδών σε αλλοπάτριους και συμπάτριους πληθυσμούς ιχθύων και ο προσδιορισμός του λειτουργικού τους ρόλου στο γαστρεντερικό τους σύστημα. Η βακτηριακή ανίχνευση στο DNA των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε με μεθόδους αλληλούχισης νέας γενιάς (Roche 454 FLX titanium και Illumina MiSeq 2x300), στοχεύοντας την περιοχή V3-V4 του γονιδίου 16S rRNA.Η μελέτη των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων σε εκτρεφόμενα άτομα (4-6) αλλοπάτριων πληθυσμών ιχθύων (S. aurata και D. labrax), από πέντε διαφορετικές και απομακρυσμένες μεταξύ τους μονάδες εκτροφής στην Ελλάδα (Ηγουμενίτσα, Αταλάντη, Γιάλτρα, Χίο, Χανιά), έδειξε ότι η γεωγραφική θέση – απόσταση, δεν επηρέασε σημαντικά τη δομή και σύνθεση των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων σε διαφορετικούς πληθυσμούς του ίδιου είδους, αλλά ούτε μεταξύ των διαφορετικών ειδών ιχθύων. Μάλιστα ανεξαρτήτου γεωγραφικής θέσης οι ιχθυοπληθυσμοί του κάθε είδους παρουσίασαν μια μικρή ομάδα κοινών OTUs (8 OTUs στο S. aurata και 10 στο D. labrax), ενώ 5 OTUs βρέθηκαν κοινά και στα δύο είδη, υποδεικνύοντας την παρουσία κοινών βακτηριακών εκπροσώπων ακόμα και μεταξύ διαφορετικών ειδών ιχθύων. Ο λόγος του μικρού αριθμού κοινών OTUs πιθανόν να οφείλεται στις ατομικές μεταβολές που παρατηρήθηκαν στις γαστρεντερικές βακτηριακές κοινότητες, ακόμα και σε άτομα μεταξύ των ίδιων πληθυσμών και πιθανόν να σχετίζονται με γενετικούς παράγοντες. Τα βακτηριακά είδη στο γαστρεντερικό σύστημα του κάθε είδους ιχθύος φαίνεται να παρουσιάζουν συνεργατικές αλληλεπιδράσεις και διαδραματίζουν διαφορετικούς βιολογικούς ρόλους στο κάθε είδος που μελετήθηκε (S. aurata και D. labrax).Για περαιτέρω μελέτη της επίδρασης της γεωγραφικής θέσης στην σύνθεση και δομή των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων των ιχθύων, μελετήθηκαν δείγματα μεσέντερου από άτομα (3-5) συμπάτριων εκτρεφόμενων πληθυσμών των ειδών ιχθύων D. puntazzo, P. pagrus, A. regius, S. aurata και D. labrax. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι παρόλο που οι γαστρεντερικές βακτηριακές τους κοινότητες δεν παρουσίασαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές, μόνο ένα μικρό ποσοστό των OTUs (3,9%) βρέθηκε να είναι κοινό μεταξύ των προαναφερθέντων ειδών ιχθύων. Τα αποτελέσματα αυτά, υποδεικνύουν επιλεκτικές πιέσεις, ευνοώντας την εποίκιση και ανάπτυξη συγκεκριμένων βακτηριακών ειδών στο γαστρεντερικό σύστημα των πέντε ειδών ιχθύων.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη της επίδρασης των συνθηκών εκτροφής στην πρώτη αποίκιση και διαδοχή των βακτηριακών κοινοτήτων σε ιχθύδια των ειδών S. aurata και S. salar, υπέδειξαν ομοιότητες μεταξύ των εκτρεφόμενων ειδών και των βακτηριακών κοινοτήτων του νερού εκτροφής και των παρεχόμενων τροφών. Ωστόσο πλήρη επικάλυψη μεταξύ αυτών δεν παρατηρήθηκε. Και στις δύο περιπτώσεις, σημαντική παρατήρηση αποτέλεσε η ανίχνευση OTUs στα γονιμοποιημένα αυγά των δύο εκτρεφόμενων ειδών, που δεν ανιχνεύθηκαν στο νερό εκτροφής, υποδεικνύοντας την πιθανή προέλευση τους από το μικροβίωμα των γεννητόρων. Γενικά η τροφή δεν επηρέασε σημαντικά την σύνθεση και δομή των βακτηριακών κοινοτήτων κατά τα χρονικά σημεία που μελετήθηκαν, ούτε στην περίπτωση της υποκατάστασης τουιχθυελαίου με έλαιο φυτικής προέλευσης, σε διατροφική μεταχείριση του είδους S. salar. Αντιθέτως, στο είδος αυτό ο παράγοντας της ηλικίας φάνηκε να επιδρά στη βακτηριακή ποικιλομορφία του γαστρεντερικού του συστήματος.Θα πρέπει να αναφερθεί ότι μέσα από τη φυλογενετική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στις βακτηριακές κοινότητες όλων των ειδών που μελετήθηκαν, καταγράφηκε επικράτηση των βακτηριακών φύλων Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria και Bacteroidetes. Τα OTUs που ανιχνεύθηκαν σχετίζονται με βακτηριακά είδη που απομονώθηκαν από παρόμοια περιβάλλοντα, ενώ μερικά από αυτά (Weissela cibaria, Pseudomonas veronii, Ruegeria mobile κλπ.), όπως έχει καταγραφεί μέσα από άλλες εργασίες, φαίνεται να παρέχουν προβιοτικές ιδιότητες στα είδη ιχθύων που μελετήθηκαν εδώ.Συνολικά η παρούσα Διδακτορική διατριβή, συμβάλει στην διεύρυνση των γνώσεων μας για την σύνθεση και δομή των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων των ιχθύων, στις πιθανές βιολογικές τους σχέσεις και προσδιόρισε τους παράγοντες που τη μεταβάλλουν.

16s rRNA高通量测序技术在人类医学中的应用进展

本文主要概述了16s rRNA高通量测序技术的特点和主要操作流程以及Roche 454 GS Life Sciences焦磷酸测序、Illumina Solexa聚合酶测序和ABI SOLiD 连接酶测序3种测序技术的优势、16s rRNA高通量测序技术在口腔、肠道微生物种属鉴定的应用。

Pyrosequencing study of caecal bacterial community of rabbit does and kits from a farm affected by epizootic rabbit enteropathy

<p>Epizootic Rabbit Enteropathy (ERE) is a disease of unknown aetiology that mainly affects post-weaning animals. Caecotrophs from animals in a farm affected by ERE were analysed to identify changes in the microbiological profile of growing rabbits. Does and kits at weaning (28 d) and the same rabbits ten days later (38 d) were used for a comparison using Roche 454 pyrosequencing of hypervariable V3-V5 regions of the 16S <em>rRNA</em> genes. The caecal bacterial community was dominated by the Firmicutes phylum (about 80%), followed by Bacteroidetes (15%), although relative abundances changed according to animal age (among does and kits at 28 and 38 d) and health status (affected or not by ERE). Two dominant families were classified within the Firmicutes phylum: Ruminococcaceae and Lachnospiraceae (50 and 20% of the sequences, respectively). In kits affected by ERE, relative abundance of <em>Ruminococcus</em> and <em>Bacteroides</em> genera decreased and increased, respectively, compared to healthy kits at the same age (28 and 38 d). The principal coordinate analysis plot revealed that kits at 28 d of age cluster together and apart from the does and the healthy 38-d rabbit groups. When only growing rabbits are considered, kits that showed symptoms of ERE clustered separately. Results suggest a different caecal bacterial community of rabbits affected by ERE. These findings highlight the need to identify different stages of the disease.</p>

PHYLOSCANNER: Inferring Transmission from Within‐ and Between-Host Pathogen Genetic Diversity

A central feature of pathogen genomics is that different infectious particles (virions, bacterial cells, etc.) within an infected individual may be genetically distinct, with patterns of relatedness amongst infectious particles being the result of both within-host evolution and transmission from one host to the next. Here we present a new software tool, phyloscanner, which analyses pathogen diversity from multiple infected hosts. phyloscanner provides unprecedented resolution into the transmission process, allowing inference of the direction of transmission from sequence data alone. Multiply infected individuals are also identified, as they harbour subpopulations of infectious particles that are not connected by within-host evolution, except where recombinant types emerge. Low-level contamination is flagged and removed. We illustrate phyloscanner on both viral and bacterial pathogens, namely HIV-1 sequenced on Illumina and Roche 454 platforms, HCV sequenced with the Oxford Nanopore MinION platform, and Streptococcus pneumoniae with sequences from multiple colonies per individual. phyloscanner is available from https://github.com/BDI-pathogens/phyloscanner.

Draft Genome Sequences of Two Strains of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Displaying Different Virulence in an Experimental Chicken Model

ABSTRACT Salmonella enterica serovar Typhimurium strains 22495 and 22792, obtained from wild birds, were found to display different virulence attributes in an experimental chicken model. Closed genome sequences were assembled after sequencing with the Roche 454 and Illumina MiSeq platforms. An additional plasmid was present in the more virulent strain 22495.