Endophytic fungal isolation from Blumea axillaris: Identification and biological activity of secondary metabolites

Medicinal plants are a wealthy source of natural medicinal properties and remain as base for new drug discoveries. Endophyte from the specific medicinal plants produce the analogous metabolites as that of the host plant. The metabolites from the endophytes comprise maximum therapeutic properties and have been extensively applied in treating various diseases and disorders. This study was focused on identification of the endophytic fungi from the medicinal plant Blumea axillaris and investigates the diversity of endophytic fungi from various explants of the same plant. The explants were cultured on potato dextrose agar and 6 endophytic fungi were successfully isolated from Blumea axillaris. They were identified morphologically and confirmed with molecular analysis as Xylaria arbuscula, Paraphoma radicina, Phomopsis phaseoli, Sordaria fimicola, Aspergillus amstelodami, Diaporthe eucalyptorum. The DNA sequences were analyzed by BLAST and the phylogenetic tree was constructed with neighbor joining method. The six isolates were subjected to antagonistic activity for the selection of potential strain and the bioactive strain Xylaria arbuscula was selected for the production of secondary metabolites by optimization. The parameters like pH, temperature, incubation period, carbon and nitrogen (organic and inorganic source) were optimized for secondary metabolite production. The fungal metabolite was extracted by solvent extraction method using polar and non-polar solvents like propanol, methanol, chloroform, acetone and ethyl acetate. To investigate the bioactivities of the fungal crude extract was subjected first for its antioxidant activity using DPPH radical scavenging method, followed by antimicrobial activity of methanolic (MeOH) extract of Xylaria arbuscula, that were also analyzed by the agar well-diffusion method against the clinical pathogens Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pnuemoniae, Proteus mirabilis, Aspergillus niger and Candida albicans.

FUNGAL PATHOGENS OF TOMATO IN SOUTH-WESTERN RUSSIA (KRASNODAR TERRITORY)

During a study of fungal diseases of tomato in the South of Russia (Krasnodar Territory) 56 fungal isolates associated with tomato fruits were obtained. Most of them belonged to the species Alternaria alternata. Alternaria solani, Fusarium equiseti, Phomopsis phaseoli, Chaetomium cochliodes, Clonostachys sp., Irpex lacteus, Colletotrichum coccodes were also identified. Laboratory experiments revealed that Clonostachys sp., C. сochliodes, P. phaseoli, I. lacteus, and F. equiseti developed well on the fruit’s slices. Fusarium equiseti was the only species that can penetrate the tomato through epidermis and infect entire fruit. The most effective fungicide against F. equiseti was difenoconazole (EC50 = 0.08 mg/L); pencycuron was also effective (EC50 = 32.5 mg/L). Thiabendazole completely inhibited the growth of F. equiseti at the concentration 100 mg/L (EC50 = 47 mg/L).

ATIVIDADE DE BIOEXTRATOS NO DESENVOLVIMENTO DE PHOMOPSIS PHASEOLI VAR. SOJAE, FUSARIUM SP. E NO TRATAMENTO DE SEMENTES DE SOJA

As doenças de plantas são responsáveis por perdas econômicas em todos os cultivos, afetam as plantas no campo e as sementes durante o armazenamento. Diferentes técnicas de controle de patógenos são utilizadas para minimizar impactos negativos, entre elas têm-se usado bioextratos, os quais se apresentam como alternativas desejáveis comparados ao controle químico convencional. O presente estudo objetivou avaliar a atividade antifúngica in vitro e in vivo de extratos de pinhão manso (Jatropha curcas L.), cipreste (Cupressus sp.) e tiririca (Cyperus rotundus L.), alho (Allium sativum L.) cebola (Allium cepa L.) e gengibre (Zingiber officinalis L.) com diferentes processos de elaboração, contra Phomopsis phaseoli var. sojae, Fusarium sp., e a influência na germinação e no vigor de sementes de soja. Os bioextratos foram preparados utilizando-se 40 g de plantas (in natura e seco a 55± 2°C) e solução água-metanol (1:3). Os extratos, após filtrados e evaporado o álcool, foram divididos em duas frações, uma delas foi autoclavada e ambas aplicadas nos isolados de culturas puras e diretamente nas sementes de soja. A secagem promoveu melhora na eficiência dos bioextratos de alho, cebola e gengibre no controle in vitro de Phomopsis phaseoli var. sojae enquanto que os de cipestre e pinhão manso foram menos efetivos. A autoclavagem resultou em perda da capacidade fungitóxica do bioextrato de alho, enquanto no de cebola afetou negativamente o vigor das sementes a 10% v/v. O extrato de alho seco não autoclavado controlou eficientemente o desenvolvimento de Phomopsis phaseoli var. sojae in vitro. Os demais bioextratos não apresentaram eficiência significativa no controle dos patógenos. Todos os bioextratos conferiram à semente de soja índice de germinação inferior quando comparado ao tratamento com Carbendazin+Tiran. O bioextrato de cebola, gengibre ambos in natura não autoclavado e de tiririca desidratada não autoclavado melhoraram significativamente o percentual de plântulas normais, comparado à testemunha. Entretanto, os bioextratos não diminuíram a contaminação das sementes por Fusarium spp. e Phomopsis phaseoli var. sojae. Portanto, o processo de autoclavagem é uma etapa importante podendo afetar de maneira diferente a eficiência dos bioextratos estudados, assim como o processo de secagem da matéria vegetal antes da preparação dos bioextratos.

Etiology of phomopsis root rot in soybean

In a survey of damages caused by soybean root rot to crops in the south of Brazil for several years, a root rot caused by Phomopsis sp has been found with increasing frequency. The primary symptoms are seen when the main root is cut longitudinally, including the death of the wood which shows white coloration and well-defined black lines that do not have a defined format. Thus, based on similarity, it has been called geographic root rot due to its aspect resembling irregular lines that separate regions on a map. In isolations, colonies and alpha spores of Phomopsis have prevailed. Pathogenicity test was done by means of inoculation in the crown of plants cultivated in a growth chamber. The geographic symptoms were reproduced in plants and the fungus Phomopsis sp. was reisolated. In soybean stems naturally infected with pod and stem blight, geographic symptoms caused by Phomopsis phaseoli are found. To the known symptoms on stems, pods and grains, that of root rot caused by P. phaseoli is now added.

Severidade da mela da soja causada por Rhizoctonia solani AG-1 IA em função de doses de potássio

O fungo Rhizoctonia solani pertencente ao grupo de anastomose 1 IA (AG-1 IA) é um dos patógenos mais importantes afetando a cultura da soja no Brasil. Este fungo causa queima da folha e/ou mela em soja, para a qual medidas de manejo cultural são consideradas alternativas importantes para controle antes do estabelecimento da doença. Há evidências de que a adubação potássica diminui substancialmente a severidade dos sintomas de várias doenças da soja como a queima foliar (Cercospora kikuchii), a seca da haste e da vagem (Phomopsis phaseoli var. sojae) e o cancro da haste (Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis). Apesar das evidências do efeito do potássio no controle de várias doenças da soja, não há informação na literatura sobre o efeito desse nutriente no controle da mela. A hipótese testada foi que a mela da soja pode ser controlada através de incrementos na adubação potássica. De maneira geral, concluiu-se que, sob condições de casa de vegetação, o incremento de K no solo não resultou no controle da mela da soja. É necessário, entretanto, confirmar esta observação conduzindo-se experimentos sob condições de campo, podendo-se incluir a avaliação do efeito da doença sob aspectos da produção.

Identificação de marcadores RAPD ligados a um gene de resistência ao cancro da haste da soja

O cancro da haste da soja (Glycine max) é uma importante doença causada pelo fungo Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis/Phomopsis phaseoli f. sp. meridionalis. Visando identificar marcadores RAPD associados a genes de resistência ao cancro da haste, causado pelo isolado CH8, presentes na linhagem UFV 91-61, foi realizado, inicialmente, um estudo sobre a herança da resistência, por meio do cruzamento desta linhagem com a variedade suscetível Paranaíba. Os resultados indicaram que um gene dominante controla a resistência a este isolado. Através de análises com marcadores moleculares na população F2 foram identificados dois marcadores RAPD produzidos pela amplificação do primer OPAB19. Os dois fragmentos de DNA de aproximadamente 1.150 e 1.320 pb produzidos por este primer estão ligadas em fases de repulsão e acoplamento, respectivamente, a uma distância de 4,7 cM do gene de resistência da linhagem UFV 91-61. Estes marcadores poderão ser usados para monitorar a introgressão deste gene em cultivares de soja adaptados e abre a possibilidade de uma sistemática procura de marcadores ligados a outros genes de resistência para o cancro da haste da soja, os quais poderiam ser posteriormente piramidados num único background genético.

First Report on Pathogenic Variability of Different Isolates of Diaporthe phaseolorum var. meridionalis on Soybean in Argentina

The objective of this study was to characterize the pathogenicity of several local isolates of Diaporthe phaseolorum (Cooke & Ellis) Sacc. var. meridionalis Fernández and its anamorph, Phomopsis phaseoli (Desmaz.) Sacc. meridionalis Morgan-Jones, the causal agent of southern stem canker of soybean (Glycine max (L.) Merr.), in soybean lines carrying major resistance genes. Soybean plants with typical stem canker symptoms were collected during the 1996 to 1997 and 1997 to 1998 growing seasons in the central and southern areas of Santa Fe Province, Argentina. The pathogen was isolated from the internal tissues of infected stems, cultured on potato glucose agar acidified with 0.2% lactic acid (APGA), amended with streptomycin at 100 mg/liter, and maintained in the dark at 25 ± 1°C. Isolates were characterized based on the morphology of colonies, perithecia, and pycnidia and measurement of asci, bicellular, biguttulate ascospores, and alpha conidia (1). Soybean cultivars used to assay pathogenicity included Tracy M (Rdc1 and Rdc2 genes), Isoline I (Tracy Misoline with only the Rdc1 gene), Isoline II (Tracy M isoline with only the Rdc2 gene), Crockett (Rdc3 gene), Hutchinson (Rdc4 gene), and RA 702 (susceptible cultivar). Hypocotyls of 14-day-old seedlings grown in the greenhouse were inoculated by the toothpick method. Four replicates of nine seedlings each were used. Seedlings punctured with sterile toothpicks served as controls. The experiment was repeated twice with similar results. The D. phaseolorum var. meridionalis isolates assayed and their collection locations were Dpm1 (Malabrigo), Dpm2 (Los Molinos), Dpm3 (San Justo), Dpm5 (Oliveros), Dpm6 (San Jerónimo), and Dpm7 (Clarke). Twenty-eight days after inoculation, stem canker reactions were measured as the percentage of dead plants. The pathogen was reisolated from stems of randomly chosen symptomatic plants on day 14 after inoculation. These plants were included in the calculation of the percentage of dead plants. In control plants, lesions were not detected, and mycelial growth did not occur from stem portions plated on APGA. Tracy M and RA 702 had 0 to 7% dead plants and 70 to 95% dead plants, respectively, with all assayed isolates. Cultivars with single resistance genes reacted differently to various isolates. Isolates Dpm1 and Dpm3 caused little or no stem canker (<10% dead plants) on all cultivars with resistance genes. Isolates Dpm2 and Dpm6 killed 56 and 52%, respectively, of Isoline II (Rdc2 gene) plants. Isolates Dpm2 and Dpm7 killed 25% of cv. Hutchinson (Rdc4 gene) and Isoline I (Rdc1 gene) plants, respectively. Isolate Dpm5 killed <12% of plants with genes Rdc1, Rdc2, or Rdc3. The reaction of isolate Dpm5 with Hutchinson (Rdc4 gene) was not evaluated. The pathogenic diversity of these isolates of D. phaseolorum var. meridionalis may have been induced by the wide diffusion of resistant host cultivars (2). References: (1) F. A. Fernández and R. T. Hanlin. Mycologia 88:425, 1996. (2) A. W. Zhang et al. Phytopathology 88:1306, 1998.

SOJA IAC/IAS-5: CULTIVAR RESISTENTE AO CANCRO DA HASTE

Há aproximadamente oito anos, o cancro da haste (Phomopsis phaseoli f. sp. meridionalis/Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis) da soja tem sido o principal fator limitante da produtividade em áreas de manifestação da doença. O seu controle mediante cultivares resistentes é o método mais econômico. Num ensaio em casa de vegetação, visando avaliar o efeito de doses de potássio no controle do cancro da haste, no cultivar IAS-5, moderadamente resistente, verificou-se haver plantas altamente resistentes, comprovadas em três gerações, todas inoculadas com o fungo causador da doença. A importância da obtenção do IAS-5 e de sua multiplicação deve-se a ser o mais cultivado no Estado de São Paulo e apresentar resistência ao cancro da haste.