Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 (type 2 diabetes mellitus - T2D) είναι μία μεταβολική νόσος, η οποία έχει αναδειχθεί σε ένα πολύ σοβαρό πρόβλημα υγείας στις μέρες μας με διαρκώς αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης. Χαρακτηρίζεται από χρόνια φλεγμονή και αντίσταση στην ινσουλίνη και έχει συσχετιστεί με επιρρέπεια σε λοιμώξεις και διαταραχή του μηχανισμού επούλωσης τραύματος, συνθήκες οι οποίες προκαλούν σοβαρές επιπλοκές και αυξάνουν τα ποσοστά θνησιμότητας.Τα εξωκυττάρια δίκτυα χρωματίνης των ουδετερόφιλων (neutrophil extracellular traps - NETs) αποτελούν βασικό μηχανισμό άμυνας έναντι των λοιμώξεων, όμως έχουν συσχετιστεί και με την παθογένεια διαφόρων μη λοιμωδών νοσημάτων, συμπεριλαμβανομένου του T2D. Ο ρόλος τους στην παθογένεια των διαφορετικών νοσημάτων καθορίζεται κατά κύριο λόγο από το πρωτεϊνικό τους φορτίο. Ο διαβήτης τύπου 2 χαρακτηρίζεται από μία κατά κάποιο τρόπο απορυθμισμένη ΝΕΤωση, στα πλαίσια της οποίας σχηματίζονται NETs με ασταθή δομή. Μάλιστα, η υπέρμετρη και συγχρόνως «ελαττωματική» ΝΕΤωση στον T2D έχει εμπλακεί στην επιρρέπεια σε βακτηριακές λοιμώξεις και στη διαταραχή του μηχανισμού επούλωσης τραύματος που συχνά χαρακτηρίζουν τους διαβητικούς ασθενείς.Η πρωτεΐνη LL-37 είναι ένα πεπτίδιο με αντιμικροβιακές ιδιότητες και βασικό ρόλο στην άμυνα του οργανισμού έναντι των βακτηριακών λοιμώξεων, το οποίο εκφράζεται από διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς, ένας εκ των οποίων είναι τα ουδετερόφιλα. Πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου μας κατέδειξε ότι το ευρέως χρησιμοποιούμενο στην καθημερινή κλινική πράξη αντιβιοτικό κλαριθρομυκίνη επάγει την απελευθέρωση «διακοσμημένων» με LL-37 NETs, τα οποία φέρουν ισχυρές αντιμικροβιακές ιδιότητες. Επίσης, η πρωτεΐνη LL-37 έχει συσχετιστεί με το μηχανισμό επούλωσης τραύματος, καθώς επάγει την αγγειογένεση και τη φάση ανάπλασης του ιστού.Λαμβάνοντας υπόψιν την αντιμικροβιακή δράση της πρωτεΐνης LL-37 και τις ευεργετικές της ιδιότητες αναφορικά με την ικανότητά της να επάγει το μηχανισμό επούλωσης τραύματος, αλλά και το γεγονός ότι υπό φλεγμονώδεις συνθήκες απελευθερώνεται μέσω των NETs στον εξωκυττάριο χώρο, στα πλαίσια της παρούσας μελέτης διερευνήθηκε η πιθανή παρουσία της πρωτεΐνης LL-37 πάνω στα διαβητικά NETs. Με τη χρήση της τεχνικής του ανοσοφθορισμού, φάνηκε πως τόσο τα ουδετερόφιλα των υπεργλυκαιμικών ασθενών με ανεπαρκή γλυκαιμικό έλεγχο (treatment-naive) όσο και εκείνα των ευγλυκαιμικών ασθενών με επαρκή γλυκαιμικό έλεγχο (well-controlled) απελευθερώνουν «αυθόρμητα» NETs που είναι «διακοσμημένα» με την πρωτεΐνη LL-37.Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την αντιμικροβιακή δράση των «διακοσμημένων» με LL-37 διαβητικών NETs. Συγκεκριμένα, βακτήρια του στελέχους E. coli NCTC 9001 καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία ή όχι in vitro παραχθέντων T2D NETs. Αν και «διακοσμημένα» με την πρωτεΐνη LL-37, τα διαβητικά NETs δεν είχαν καμία ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των βακτηρίων, ανεξαρτήτως αν προέρχονταν από τα ουδετερόφιλα treatment-naive ή well-controlled ασθενών.Με βάση αυτό το εύρημα, διερευνήσαμε αν η κλαριθρομυκίνη θα μπορούσε να αποκαταστήσει την αντιβακτηριακή δράση των διαβητικών NETs in vitro. Συνεπώς, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες των βακτηρίων E. coli NCTC 9001 υπό την παρουσία NETs που παρήχθησαν από διαβητικά ουδετερόφιλα, μετά από in vitro διέγερσή τους με κλαριθρομυκίνη. Μόνο τα NETs που σχηματίστηκαν μετά από διέγερση με κλαριθρομυκίνη των ουδετερόφιλων well-controlled ασθενών περιόρισαν σημαντικά την ανάπτυξη των βακτηρίων, όμως η αντιβακτηριακή τους δράση περιορίστηκε σημαντικά όταν η προσδεδεμένη σε αυτά πρωτεΐνη LL-37 ανεστάλη με τη χρήση κατάλληλου αντισώματος. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η κλαριθρομυκίνη αποκαθιστά in vitro την αντιβακτηριακή δράση των NETs που απελευθερώνονται από ουδετερόφιλα ευγλυκαιμικών ασθενών, μία επίδραση η οποία φαίνεται να μεσολαβείται από την προσδεδεμένη στα NETs πρωτεΐνη LL-37.Η κλαριθρομυκίνη δεν επηρέασε την ικανότητα των διαβητικών ουδετερόφιλων να απελευθερώνουν «αυθόρμητα» NETs, όπως αξιολογήθηκε με τη χρήση της μεθόδου MPO-DNA complex ELISA, όμως αύξησε σημαντικά τα επίπεδα της προσδεδεμένης πάνω στα well-controlled NETs πρωτεΐνης LL-37, όπως διερευνήθηκε με τη χρήση των τεχνικών western blot και LL-37 ELISA. Συνεπώς, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι η ενισχυμένη in vitro αντιβακτηριακή δράση των επαγόμενων από κλαριθρομυκίνη well-controlled T2D NETs θα μπορούσε να αποδοθεί στα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης LL-37 που «διακοσμεί» αυτά τα NETs.Λαμβάνοντας υπόψιν τις διαρκώς αυξανόμενες ενδείξεις στη βιβλιογραφία ότι η πρωτεΐνη LL-37 μπορεί να επάγει το μηχανισμό επούλωσης τραύματος, διερευνήσαμε αν τα «διακοσμημένα» με LL-37 T2D NETs εμπλέκονται στη διαδικασία επούλωσης τραύματος, αλλά και αν η κλαριθρομυκίνη θα μπορούσε να επιδράσει ευεργετικά. Συγκεκριμένα, ανθρώπινοι ινοβλάστες δέρματος καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία T2D NETs που παρήχθησαν in vitro «αυθόρμητα» ή μετά από διέγερση με κλαριθρομυκίνη, προκειμένου να μελετήσουμε την επίδρασή τους στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των ινοβλαστών δέρματος σε μυοϊνοβλάστες. Τα επαγόμενα με κλαριθρομυκίνη NETs από ουδετερόφιλα well-controlled ασθενών είχαν σημαντική επαγωγική δράση στην ενεργοποίηση και τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών, η οποία αποδόθηκε στα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης LL-37 που «διακοσμεί» αυτά τα NETs, καθώς περιορίστηκε σημαντικά όταν ανεστάλη η LL-37 με τη χρήση κατάλληλου αντισώματος. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται περαιτέρω από το τελευταίο εύρημά μας, σύμφωνα με το οποίο τα NETs στο διαβήτη τύπου 2 δεν είναι «διακοσμημένα» με την πρωτεΐνη IL-17, μία πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι επίσης επάγει την ινωτική δραστηριότητα των ινοβλαστών όταν βρίσκεται πάνω σε NETs, αλλά ούτε και η κλαριθρομυκίνη επάγει την έκφρασή της.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει πως η κλαριθρομυκίνη θα μπορούσε να ωφελήσει περαιτέρω τους ευγλυκαιμικούς ασθενείς με διαβήτη τύπου 2, ενισχύοντας την αποτελεσματικότητα των ουδετερόφιλών τους έναντι των βακτηριακών λοιμώξεων και συγχρόνως βελτιώνοντας την ικανότητα των ινοβλαστών τους για επούλωση τραυμάτων, μέσω αύξησης των επιπέδων της πρωτεΐνης LL-37 πάνω στα NETs.
Neutrophil extracellular traps (NETs)-mediated killing of carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae (CR-hvKP) are impaired in patients with diabetes mellitus