Μοριακοί μηχανισμοί ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία με πλατίνη

Mapping Intimacies ◽

10.12681/eadd/41726 ◽

2014 ◽

Author(s):

Δήμητρα Στεφάνου

Keyword(s):

Ex Vivo ◽

Tail Moment ◽

Olive Tail Moment

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί την τέταρτη αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών. Με την χρήση των πλατινούχων παραγόντων στη χημειοθεραπεία του καρκίνου αυτού παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στα ποσοστά πενταετούς και συνολικής επιβίωσης, χωρίς, όμως, να επιτυγχάνεται ίαση της νόσου. Μία από τις βασικές αιτίες της τελικής αποτυχίας είναι η ανάπτυξη αντοχής στα φάρμακα αυτά. Πολλές ερευνητικές εργασίες έχουν δείξει ότι οι μηχανισμοί αντοχής είναι πολυπαραγοντικοί, με την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA να συμβάλλει σε σημαντικό ποσοστό. ΣΤΟΧΟΙ: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της βλάβης που προκαλείται στο DNA από πλατινούχους παράγοντες και η διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών που επάγονται μετά την αναγνώριση της βλάβης από το κύτταρο. Με δεδομένη τη σημασία της επιδιόρθωσης στην επιβίωση του καρκινικού κυττάρου και ως εκ τούτου στην ανταπόκριση του ασθενούς στη χημειοθεραπεία καθώς και το γεγονός ότι οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται μέχρι στιγμής για τον προσδιορισμό της δεν μπορούν εύκολα να χρησιμοποιηθούν στη κλινική πρακτική, αναπτύξαμε κατ΄αρχήν τρεις καινούργιες ευαίσθητες μεθοδολογίες (ποσοτική PCR, η αλκαλική μέθοδος δημιουργίας κομητών, μέτρηση της επαγωγής γH2AX με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας), που δίνουν αξιόπιστα αποτελέσματα σε σύντομο χρονικό διάστημα. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το πειραματικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών. Στα κύτταρα αυτά μετά την ex vivo χορήγηση πλατινούχων παραγόντων (σισπλατίνης, καρβοπλατίνης) μελετήθηκε το είδος των βλαβών στο DNA που προκαλούνται από τους παράγoντες αυτούς και η κινητική σχηματισμού/επιδιόρθωσης των βλαβών χρησιμοποιώντας ανάλυση κατά Southern και ποσοτικό PCR. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοφθορισμού και συνεστιακής μικροσκοπίας έγινε διερεύνηση των μορίων (γΗ2ΑΧ, ΑΤΜ, ΑΤR, Chk1, Chk2) που επάγονται μετά την αναγνώριση της βλάβης από το κύτταρο. Τέλος, εφαρμόζοντας τις μεθοδολογίες, που αναπτύξαμε, μετρήθηκαν τα επίπεδα βλάβης/επιδιόρθωσης του DNA ή/και των ενδιαμέσων της επιδιόρθωσης της βλάβης. Τέλος, έγινε πιστοποίηση των τριών μεθοδολογιών σε επίπεδο βιολογικών δειγμάτων (απομονωμένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος) που ελήφθησαν από 9 υγιείς δότες και 18 ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών πριν τη χορήγηση χημειοθεραπείας και τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με την κλινική απόκριση των ασθενών στη χημειοθεραπεία. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2, σε κάθε μέθοδο ξεχωριστά επιλέχθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες που εξασφαλίζουν την ποσοτικοποίηση της σχέσης δόσεις πλατίνης-επιπέδων της επαγόμενης βλάβης του DNA. Σε πρώτη φάση, διερευνήθηκε το είδος των βλαβών της πλατίνης που ανιχνεύεται με τη μέθοδο του ποσοτικού PCR και η κινητική σχηματισμού τους χρησιμοποιώντας ως μέθοδο ελέγχου την ανάλυση κατά Southern. Μετά από σύγκριση των επιπέδων βλαβών που μετρώνται με τη ποσοτική PCR με εκείνα που ανιχνεύονται με την ανάλυση κατά Southern στα ίδια δείγματα, βρέθηκε ότι η μέθοδος της ποσοτικής PCR μετράει το σύνολο των βλαβών που δημιουργούνται από τα παράγωγα της πλατίνης. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα των ολικών βλαβών που προκαλούνται από τη σισπλατίνη φτάνουν σε πλατό μέσα στις 3 πρώτες ώρες χορήγησης, ενώ οι σταυροδεσμοί αυξάνονται συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζοντας μέγιστη τιμή στις 24 ώρες. Αντιθέτως, στην περίπτωση της καρβοπλατίνης οι ολικές βλάβες καθώς και οι σταυροδεσμοί αυξάνονται συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζοντας μέγιστη τιμή στις 24 ώρες. Με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας αποδείχθηκε ότι η γH2Ax είναι το πρώτο μόριο που επάγεται, στη συνεχεία, ενεργοποιείται το μονοπάτι ATR - Chk1 και ακολούθως το μονοπάτι ATM - Chk2. Χρησιμοποιώντας την αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών βρήκαμε ότι οι βλάβες που δημιουργούνται από τη καρβοπλατίνη στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος των ασθενών που ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερες από εκείνες των ασθενών που δεν ανταποκρίθηκαν (p=0,05). Συγκεκριμένα, ο μέσος όρος Olive Tail Moment (OTM, αυθαίρετες μονάδες που αποτελούν μέτρο του επιπέδου βλαβών του DNA), που μετρήθηκε στους ευαίσθητους ασθενείς βρέθηκε 13927,42 ενώ στους ανθεκτικούς ήταν 7834,25. Χρησιμοποιώντας το προσδιορισμό επαγωγής γH2AX με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας οι μετρήσεις οδήγησαν στα ίδια ακριβώς συμπεράσματα όπως και στην αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών με στατιστική σημαντικότητα (p=0,03). Συγκεκριμένα, μετρώντας τα επίπεδα επιδιορθωτικής ικανότητας μεταξύ των ασθενών, όπως αυτά εκφράζονται με τη μέτρηση του εμβαδού της περιοχής κάτω από την καμπύλη [(% ποσοστό με >5 εστίες γH2AX) x δόση], βρέθηκε ότι ευαίσθητοι ασθενείς εμφανίζουν τιμή 15765,83, ενώ οι ανθεκτικοί 12846,66. Επίσης, και με τις δύο μεθοδολογίες διαπιστώθηκε ότι οι ενδογενείς βλάβες των υγιών δοτών είναι στατιστικά σημαντικά χαμηλότερες σε σχέση με τους ασθενείς (p<0,001). Τέλος, μια άλλη παρατήρηση ήταν ότι οι υγιείς δότες επάγουν χρώση όλου του πυρήνα του κυττάρου (panuclear, αποτελεί μέτρο της αποπτωτικής διαδικασίας) σε μικρότερο ποσοστό σε σχέση με τους ασθενείς που σημαίνει ότι οι τελευταίοι εμφανίζουν μικρότερη ικανότητα επαγωγής της αποπτωτικής διαδικασίας (p=0,01), ένα βιολογικό χαρακτηριστικό που μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα της χημειοθεραπείας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Στη παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε η επαγωγή των μορίων που εμπλέκονται στα κυτταρικά μονοπάτια αναγνώρισης της βλάβης από τη πλατίνη και μεταγωγής του σήματος (γH2AX, ATR, Chk1, ATM, Chk2). Ακόμα αποδείχτηκε ότι η επιδιόρθωση των βλαβών DNA αποτελεί σημαντικό παράγοντα που συμβάλλει στο αποτέλεσμα της χημειοθεραπείας με παράγωγα πλατίνης. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι οι αλλαγές στην ικανότητα επιδιόρθωσης των καρκινικών κυττάρων αντικατοπτρίζεται στα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (ιστός δείκτης) κάτι που σημαίνει ότι η μέτρηση βλάβης/επιδιόρθωσης σε λεμφοκύτταρα μπορεί να αποτελέσει μοριακό δείκτη πρόγνωσης του θεραπευτικού αποτελέσματος. Τέλος, χρησιμοποιώντας την αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών και τη μέτρηση των επιπέδων του γH2AX με ανοσοφθορισμό βρήκαμε ότι οι ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών παρουσιάζουν μεγαλύτερο αριθμό ενδογενών γονοτοξικών βλαβών από τους υγιείς δότες (κάτι που πιθανά συμβάλλει στην εξέλιξη της νόσου) και από την άλλη μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε τα άτομα που θα ωφεληθούν από τη μετέπειτα χορήγηση της χημειοθεραπείας. Τα αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να αξιοποιηθούν στην ανάπτυξη ευαίσθητων μοριακών δεικτών για τη έγκαιρη διάγνωση της ασθένειας και τη πρόγνωση της κλινικής απόκρισης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών στη χημειοθεραπεία με παράγοντες πλατίνης.

Download Full-text

Untersuchungen zum Schädigungspotenzial durch den Konsum von E-Zigaretten

HNO ◽

10.1007/s00106-021-00998-2 ◽

2021 ◽

Author(s):

F. Wiest ◽

A. Scherzad ◽

P. Ickrath ◽

N. Poier ◽

S. Hackenberg ◽

...

Keyword(s):

Comet Assay ◽

Sandwich Elisa ◽

Liquid Interface ◽

Sich Eine ◽

Tail Moment ◽

Olive Tail Moment ◽

Air Liquid Interface

Zusammenfassung Hintergrund Die E‑Zigarette erfreut sich in den letzten Jahren zunehmender Beliebtheit. Die Frage nach der Toxizität ist jedoch noch nicht eindeutig geklärt, und es herrscht global Unsicherheit im Umgang mit der E‑Zigarette. Ziel Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Propylenglykol, ein Hauptbestandteil der Liquide, in Bezug auf mögliche akute Entzündungsreaktionen, zyto- und genotoxische Auswirkungen auf humane Nasenschleimhautzellen zu untersuchen. Material und Methoden Die Nasenschleimhautzellen wurden von zehn Probanden im Air-Liquid-Interface kultiviert und anschließend mit unterschiedlichen Konzentrationen des Propylenglykols bedampft. Die Analyse erfolgte mittels Trypanblau-Test, Comet-Assay, Mikrokerntest und IL-6- und IL-8-Sandwich-ELISA. Ergebnis Der Trypanblau-Test zeigte keine Reduktion der Vitalität. Im Sandwich-ELISA konnte kein Anstieg der IL-6- und IL-8-Konzentrationen nachgewiesen werden. Im Comet-Assay zeigte das Olive Tail Moment eine Schädigung im Vergleich zur Negativkontrolle in allen untersuchten Konzentrationen. Zudem zeigte sich eine dosisabhängige Schädigung. Im Mikrokerntest konnte ein Unterschied zwischen dem Reinstoff und der Negativkontrolle gefunden werden. Schlussfolgerung Es zeigten sich möglicherweise reparable DNS-Schädigungen im Comet-Assay. Im Mikrokerntest konnten diese nur in der Reinstoffkonzentration bestätigt werden. Es sollte ein restriktiver Umgang mit der E‑Zigarette erfolgen, bis insbesondere Langzeitstudien vorliegen. Zudem ist eine eindeutige Deklaration der Inhaltsstoffe der Liquide durch die Hersteller zu fordern, um weitergehende Schädigungspotenziale untersuchen zu können.

Download Full-text

Correlation of γ-radioactivity and Scanning Electron Microscopy in measurement of retention of 111Indium-labeled canine endothelial cells on synthetic vascular grafts

Proceedings, annual meeting, Electron Microscopy Society of America ◽

10.1017/s0424820100156419 ◽

1989 ◽

Vol 47 ◽

pp. 886-887

Author(s):

E.J. Prendiville ◽

S. Laliberté Verdon ◽

K. E. Gould ◽

K. Ramberg ◽

R. J. Connolly ◽

...

Keyword(s):

Blood Flow ◽

Ex Vivo ◽

Vascular Grafts ◽

Retention Data ◽

Vascular Prostheses ◽

Group 4 ◽

Human Fibronectin ◽

Insufficient Time ◽

Group 3 ◽

Group 2

Endothelial cell (EC) seeding is postulated as a mechanism of improving patency in small caliber vascular grafts. However the majority of seeded EC are lost within 24 hours of restoration of blood flow in previous canine studies . We postulate that the cells have insufficient time to fully develop their attachment to the graft surface prior to exposure to hemodynamic stress. We allowed EC to incubate on fibronectin-coated ePTFE grafts for four different time periods after seeding and measured EC retention after perfusion in a canine ex vivo shunt circuit.Autologous canine EC, were enzymatically harvested, grown to confluence, and labeled with 30 μCi 111 Indium-oxine/80 cm 2 flask. Four groups of 5 cm x 4 mm ID ePTFE vascular prostheses were coated with 1.5 μg/cm.2 human fibronectin, and seeded with 1.5 x 105 EC/ cm.2. After seeding grafts in Group 1 were incubated in complete growth medium for 90 minutes, Group 2 were incubated for 24 hours, Group 3 for 72 hours and Group 4 for 6 days. Grafts were then placed in the canine ex vivo circuit, constructed between femoral artery and vein, and subjected to blood flow of 75 ml per minute for 6 hours. Continuous counting of γ-activity was made possible by placing the seeded graft inside the γ-counter detection crystal for the duration of perfusion. EC retention data after 30 minutes, 2 hours and 6 hours of flow are shown in the table.

Download Full-text

Elevated level of circulatory sTLT1 induces inflammation through SYK/MEK/ERK signalling in coronary artery disease

Clinical Science ◽

10.1042/cs20190999 ◽

2019 ◽

Vol 133 (22) ◽

pp. 2283-2299

Author(s):

Apabrita Ayan Das ◽

Devasmita Chakravarty ◽

Debmalya Bhunia ◽

Surajit Ghosh ◽

Prakash C. Mandal ◽

...

Keyword(s):

Risk Factors ◽

Coronary Artery Disease ◽

Coronary Artery ◽

Chronic Inflammation ◽

Ex Vivo ◽

Human Subjects ◽

Critical Role ◽

Atherosclerotic Cardiovascular Disease ◽

Tnf Α ◽

Artery Disease

Abstract The role of inflammation in all phases of atherosclerotic process is well established and soluble TREM-like transcript 1 (sTLT1) is reported to be associated with chronic inflammation. Yet, no information is available about the involvement of sTLT1 in atherosclerotic cardiovascular disease. Present study was undertaken to determine the pathophysiological significance of sTLT1 in atherosclerosis by employing an observational study on human subjects (n=117) followed by experiments in human macrophages and atherosclerotic apolipoprotein E (apoE)−/− mice. Plasma level of sTLT1 was found to be significantly (P<0.05) higher in clinical (2342 ± 184 pg/ml) and subclinical cases (1773 ± 118 pg/ml) than healthy controls (461 ± 57 pg/ml). Moreover, statistical analyses further indicated that sTLT1 was not only associated with common risk factors for Coronary Artery Disease (CAD) in both clinical and subclinical groups but also strongly correlated with disease severity. Ex vivo studies on macrophages showed that sTLT1 interacts with Fcɣ receptor I (FcɣRI) to activate spleen tyrosine kinase (SYK)-mediated downstream MAP kinase signalling cascade to activate nuclear factor-κ B (NF-kB). Activation of NF-kB induces secretion of tumour necrosis factor-α (TNF-α) from macrophage cells that plays pivotal role in governing the persistence of chronic inflammation. Atherosclerotic apoE−/− mice also showed high levels of sTLT1 and TNF-α in nearly occluded aortic stage indicating the contribution of sTLT1 in inflammation. Our results clearly demonstrate that sTLT1 is clinically related to the risk factors of CAD. We also showed that binding of sTLT1 with macrophage membrane receptor, FcɣR1 initiates inflammatory signals in macrophages suggesting its critical role in thrombus development and atherosclerosis.

Download Full-text

The Shikani HME: A New Tracheostomy Heat and Moisture Exchanger

Journal of Speech Language and Hearing Research ◽

10.1044/2020_jslhr-19-00107 ◽

2020 ◽

Vol 63 (9) ◽

pp. 2921-2929

Author(s):

Alan H. Shikani ◽

Elamin M. Elamin ◽

Andrew C. Miller

Keyword(s):

Ex Vivo ◽

Moisture Loss ◽

Speaking Valve ◽

Time Zero ◽

In Series ◽

Turbulent Airflow ◽

The Difference ◽

Loss Efficiency ◽

Heat And Moisture ◽

Lung Simulation

Purpose Tracheostomy patients face many adversities including loss of phonation and essential airway functions including air filtering, warming, and humidification. Heat and moisture exchangers (HMEs) facilitate humidification and filtering of inspired air. The Shikani HME (S-HME) is a novel turbulent airflow HME that may be used in-line with the Shikani Speaking Valve (SSV), allowing for uniquely preserved phonation during humidification. The aims of this study were to (a) compare the airflow resistance ( R airflow ) and humidification efficiency of the S-HME and the Mallinckrodt Tracheolife II tracheostomy HME (M-HME) when dry (time zero) and wet (after 24 hr) and (b) determine if in-line application of the S-HME with a tracheostomy speaking valve significantly increases R airflow over a tracheostomy speaking valve alone (whether SSV or Passy Muir Valve [PMV]). Method A prospective observational ex vivo study was conducted using a pneumotachometer lung simulation unit to measure airflow ( Q ) amplitude and R airflow , as indicated by a pressure drop ( P Drop ) across the device (S-HME, M-HME, SSV + S-HME, and PMV). Additionally, P Drop was studied for the S-HME and M-HME when dry at time zero (T 0 ) and after 24 hr of moisture testing (T 24 ) at Q of 0.5, 1, and 1.5 L/s. Results R airflow was significantly less for the S-HME than M-HME (T 0 and T 24 ). R airflow of the SSV + S-HME in series did not significant increase R airflow over the SSV or PMV alone. Moisture loss efficiency trended toward greater efficiency for the S-HME; however, the difference was not statistically significant. Conclusions The turbulent flow S-HME provides heat and moisture exchange with similar or greater efficacy than the widely used laminar airflow M-HME, but with significantly lower resistance. The S-HME also allows the innovative advantage of in-line use with the SSV, hence allowing concurrent humidification and phonation during application, without having to manipulate either device.

Download Full-text