ERH as a component of the Microprocessor facilitates the maturation of suboptimal microRNAs

ABSTRACTThe Microprocessor complex cleaves the primary transcript of microRNA (pri-miRNA) to initiate miRNA maturation. Microprocessor is known to consist of RNase III DROSHA and dsRNA-binding DGCR8. Here we identify Enhancer of Rudimentary Homolog (ERH) as a new component of the Microprocessor. ERH binds to a conserved region in the N-terminus of DGCR8. Knockdown of ERH or deletion of the DGCR8 N-terminus results in a decrease of processing of primary miRNAs with suboptimal hairpin structures that reside in polycistronic miRNA clusters. ERH increases the processing of suboptimal pri-miR-451 in a manner dependent on its neighboring pri-miR-144. Thus, the ERH dimer may mediate “cluster assistance” in which the Microprocessor is loaded onto a poor substrate with help from a high-affinity substrate in the same cluster. Our study reveals a role of ERH in the miRNA pathway.

Μελέτη της δομικής και λειτουργικής αλληλεπίδρασης πυρηνικών πρωτεϊνών κάτω από υποξία και άλλες στρεσογόνες συνθήκες

O παράγοντας SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B) είναι πρωτεΐνη της πυρηνικής μήτρας και απομονώθηκε πριν από είκοσι περίπου χρόνια με βάση το χαρακτηριστικό του να προσδένεται σε στοιχεία S/MAR (Scaffold/Matrix Attachment Region) του DNA. Ο SAFB1 με τον εξελικτικά συγγενή του SAFB2, έχουν μεταξύ τους ομολογία 74% και αποτελούν αντικείμενο έρευνας της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Αποτελούνται από την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, SAF-box στο αμινοτελικό τους άκρο, την περιοχή δέσμευσης με το RNA, RRM, ενώ στο καρβοξυτελικό τους άκρο έχουν μια περιοχή πλούσια σε επαναλήψεις Arg-Glu (R/E) που ακολουθείται από μια περιοχή πλούσια σε κατάλοιπα Arg και Gly (R, G), υπεύθυνη για τις γνωστές ως τώρα πρωτεϊνικές τους αλληλεπιδράσεις. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εξετάστηκε η ικανότητα πρόσδεσης των SAFB στη χρωματίνη μέσω της αμινοτελικής τους περιοχής, υπό την επίδραση δυο μεταβολικών στρεσσογόνων συνθηκών, της υποξίας και της στέρησης γλυκόζης. Για κάθε συνθήκη εξετάστηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα και ο υποκυτταρικός εντοπισμός τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο συνθήκες δεν επηρεάζουν τον υποκυτταρικό εντοπισμό τους αλλά τα πρωτεϊνικά επίπεδά τους. Συγκεκριμένα, η υποξία αυξάνει τα πρωτεϊνικά επίπεδα των SAFB1/2 όχι όμως στο επίπεδο της μεταγραφής και με μηχανισμό ανεξάρτητο των μεταγραφικών παραγόντων HIFs (Hypoxia-inducible factors), αλλά προκαλώντας αύξηση του διαλυτού κλάσματός τους στο πυρηνόπλασμα. Επίσης η υποξία δεν επηρέασε την δράση τους ως συγκαταστολείς της μεταγραφικής ενεργότητας του ERα (Estrogen Receptor α). Αντίθετα, η στέρηση γλυκόζης φάνηκε να μειώνει τα πρωτεϊνικά επίπεδα των SAFB1/2, χωρίς όμως να αποκλείεται αυτό να συμβαίνει στο επίπεδο της μεταγραφής.Στο δεύτερο μέρος διερευνήθηκαν οι λειτουργίες των SAFB μέσω δύο αλληλεπιδράσεων που έχουν βρεθεί στο εργαστήριο Βιοχημείας και συμβαίνουν με το καρβοξυτελικό τους άκρο. Η πρώτη αλληλεπίδραση είναι με την κινάση SRPK1 (Serine/Arginine Protein Kinase 1). Καταρχάς εξετάστηκε δομικά, όπου με πειράματα χρωματογραφίας αγχιστείας εντοπίστηκε για πρώτη φορά, ότι τα 180 C-τελικά αμινοξέα της SRPK1(473-655) είναι ικανά και απαραίτητα για την αλληλεπίδραση της με τον SAFB1. Επίσης, διερευνήθηκε λειτουργικά, μέσω εύρεσης συνθηκών όπου τα δύο μόρια SAFB και SRPK1, τα οποία κατά τ’ άλλα έχουν διαφορετικές υποκυτταρικές κατανομές, είναι πιθανόν να βρεθούν σε κοινό υποκυτταρικό εντοπισμό. Εξετάστηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα και ο υποκυτταρικός εντοπισμός της SRPK1 υπό την επίδραση της υποξίας, του οσμωτικού στρες, της στέρησης αμινοξέων και της στέρησης γλυκόζης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι καμία από τις τέσσερις συνθήκες δεν ήταν ικανή να μεταβάλλει τα πρωτεϊνικά επίπεδα της SRPK1, ενώ μόνο οι συνθήκες του οσμωτικού στρες και της στέρησης γλυκόζης προκάλεσαν μια υποκυτταρική μετατόπιση της SRPK1, σε διακριτές πυρηνικές δομές. Η δεύτερη αλληλεπίδραση που εξετάστηκε ήταν με την πρωτεΐνη ERH (Enhancer of Rudimentary Homologue), η οποία εμπλέκεται σε ποικίλες βασικές κυτταρικές διεργασίες μεταξύ των οποίων και το μάτισμα. Με πειράματα ανοσοκατακρήμινσης και χρωματογραφίας αγχιστείας βρέθηκε ότι η ERH αλληλεπιδρά άμεσα μέσα σε κύτταρα θηλαστικών μέσω των 205 καρβοξυτελικών αμινοξικών καταλοίπων των SAFB, ενώ από πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικής κλασμάτωσης δείχθηκε ότι οι δυο πρωτεΐνες συν-εντοπίζονται στην πυρηνική μήτρα. Τέλος, η ERH δεν μεταβάλλει τη λειτουργία των SAFB1/2 ως συγκαταστολείς του υποδοχέα των οιστρογόνων ERα αλλά αναιρεί την καταστολή που προκαλούν στην ενζυμική δράση της SRPK1, λογικό επακόλουθο του γεγονότος ότι SRPK1και ERH προσδένονται στην ίδια επικράτεια των SAFB1/2.Συνολικά τα παραπάνω ευρήματα θα βοηθήσουν στην εμβάθυνση και την κατανόηση των λειτουργιών των SAFB1/2 και των μοριακών παρτενέρ τους, οι οποίοι εμπλέκονται σε βασικές κυτταρικές διεργασίες όπως είναι η οργάνωση της χρωματίνης, ο μεταβολισμός του RNA και η μεταγραφή.

Drosophila Enhancer of Rudimentary Homolog, ERH, Is a Binding Partner of RPS3, RPL19, and DDIT4, Suggesting a Mechanism for the Nuclear Localization of ERH

The protein enhancer of rudimentary homolog, ERH, is a small, highly conserved protein that has been found in animals, plants, and protists. Genetic and biochemical interactions have implicated ERH in the regulation of pyrimidine biosynthesis, DNA replication, transcription, mRNA splicing, cellular proliferation, tumorigenesis, and the Notch signaling pathway. In vertebrates and insects, ERH is nuclearly localized; however, an examination of the ERH amino-acid sequence does not reveal any nuclear localization signals. In this paper we show that the first 24 amino acids contain sequences necessary and sufficient for nuclear localization. Through yeast two-hybrid screens, three new binding partners of ERH, RPS3, RPL19, and DDIT4, were identified. RPS3 was isolated from both human and Drosophila screens. These interactions suggest functions of ERH in cell growth, cancer, and DNA repair. The ERH sequences necessary for the interactions between ERH and RPS3 and RPL19 are mapped onto the same 24-amino-acid region in ERH which are necessary for nuclear localization, suggesting that ERH is localizing to the nucleus through binding to one of its DNA-binding partners, such as RPS3 or RPL19.

The human and Drosophila ERH are functionally equivalent: Evidence from transgenic studies.

<p>The <em>enhancer of rudimentary</em>, <em>e(r)</em>, gene encodes a small highly conserved protein, enhancer of rudimentary homolog (ERH), which has been shown to have a regulatory function in cell division, Notch signaling, and cancer progression.<em> </em> Human and Drosophila ERH, both 104 amino acids in length, are 76% identical and 84% similar. The high sequence identity translates into nearly identical tertiary structures. Previous studies on the expression of the human and Drosophila <em>e(r)</em> genes reveal that the two genes are similarly regulated. Data in the present study using an <em>e(r)-eGFP</em> reporter gene confirm these results, showing a high expression of the reporter in ovaries, testes, and brain. The high structural and regulatory conservation of <em>e(r)</em> and ERH argue that human and Drosophila ERH may be biochemically and functionally equivalent. To test this hypothesis, a chimeric transgene containing the Drosophila <em>e(r)</em> non-coding regions and the human <em>e(r)</em> coding region was constructed and used to establish transgenic Drosophila stocks. This transgene can rescue all of the mutant phenotypes of an <em>e(r)</em> deletion, and Drosophila stocks in which the fly ERH has been replaced with the human ERH are fully healthy and viable. These studies demonstrate that the human and Drosophila ERH are functionally equivalent, suggesting that studies on the activity of the human ERH can be done in Drosophila, where a multitude of genetic and developmental tools are available.</p>

Enhancer of Rudimentary Homolog Affects the Replication Stress Response through Regulation of RNA Processing

Accurate replication of DNA is imperative for the maintenance of genomic integrity. We identified Enhancer of Rudimentary Homolog (ERH) using a whole-genome RNA interference (RNAi) screen to discover novel proteins that function in the replication stress response. Here we report that ERH is important for DNA replication and recovery from replication stress. ATR pathway activity is diminished in ERH-deficient cells. The reduction in ATR signaling corresponds to a decrease in the expression of multiple ATR pathway genes, including ATR itself. ERH interacts with multiple RNA processing complexes, including splicing regulators. Furthermore, splicing of ATR transcripts is deficient in ERH-depleted cells. Transcriptome-wide analysis indicates that ERH depletion affects the levels of ∼1,500 transcripts, with DNA replication and repair genes being highly enriched among those with reduced expression. Splicing defects were evident in ∼750 protein-coding genes, which again were enriched for DNA metabolism genes. Thus, ERH regulation of RNA processing is needed to ensure faithful DNA replication and repair.