Abstract. Segmentation of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) images can be used to identify the presence of ALL disease. In this paper, three-level local thresholdings based on Otsu method is presented for leucocytes segmentation in ALL image. Firstly, a method based on Gram-Schmidt orthogonalization theory is applied to partition the input image into several sub-images. The proposed method extends Otsu’s bi-level thresholding to three-level thresholding method to find two local threshold values that maximize between-class variance. Using the two local threshold values and three-level local thresholding technique then segmenting each of sub-images into three regions, e.g. nucleus, cytoplasm, and background. To evaluate the performance of the proposed method, 32 peripheral blood smear images are used. The performance of the proposed method is compared with manually segmented ground truth using Zijdenbos similarity index (ZSI), precision, and recall. An experimental evaluation demonstrates superior performance over three-level global thresholding for ALL image segmentation.Keywords: three-level local thresholding, acute lymphoblastic leukemia, three-level Otsu thresholding, gram-schmidt orthogonalization Abstrak. Segmentasi citra Limfoblastik Leukemia Akut (LLA) dapat digunakan untuk mengidentifikasi kehadiran penyakit LLA. Pada penelitian ini diusulkan metode three-level local thresholding berbasis metode Otsu untuk segmentasi leukosit pada citra LLA. Pertama-tama, metode berbasis teori ortogonalisasi Gram-Schmidt diaplikasikan untuk membagi citra LLA menjadi sub-sub citra. Metode yang diusulkan memperluas metode bi-level thresholding Otsu ke dalam kasus three-level thresholding untuk pencarian dua nilai ambang lokal tiap sub-citra yang memaksimumkan varian antar kelas. Dengan nilai ambang jamak lokal tersebut, teknik three-level local thresholding selanjutnya mensegmentasi tiap sub-citra ke dalam tiga region, yaitu nukelus, sitoplasma, dan latar belakang. Untuk mengevaluasi performa metode usulan, 32 citra uji digunakan. Performa metode yang diusulkan dibandingkan dengan citra segmentasi manual menggunakan Zijdenbos similarity index (ZSI), presisi, dan recall. Hasil uji coba menunjukkan performa three-level local thresholding lebih unggul daripada metode three-level global thresholding untuk segmentasi citra LLA. Kata Kunci: three-level local thresholding, leukemia limfoblastik akut, three-level Otsu thresholding, ortogonalisasi gram-schmidt