Ανάπτυξη mRNA μορίων στη θεραπευτική προσέγγιση μεταβολικών/μονογονιδιακών νοσημάτων με την αξιοποίηση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγτής (PTDs/CPPs)

2020 ◽  
Author(s):  
Ανδρούλλα Μηλιώτου
Keyword(s):  
Protein Transduction ◽  
Protein Transduction Domains

Το in vitro μεταγραφόμενο (in vitro transcribed, IVT)-mRNA μοιάζει με το φυσικό mRNA και η επιτυχής ενδοκυττάρια μεταφορά του, επιτρέπει την παροδική έκφραση της αντίστοιχης εξωγενούς πρωτεΐνης, από τον ίδιο το μεταφραστικό μηχανισμό των κυττάρων. Το ισχυρότερο πλεονέκτημα της τεχνολογίας IVT-mRNA είναι ότι τα μόρια mRNA δεν παρεμβαίνουν στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η επιτυχημένη εφαρμογή του IVT-mRNA βασίζεται στην ανάπτυξη ασφαλούς και αποτελεσματικής μεταφοράς, η οποία παραμένει ακόμα μια πρόκληση. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή σχεδιάστηκε ως πλατφόρμα μεταφοράς, μια καινοτόμος μεθοδολογία για το συνδυασμό της τεχνολογίας των Πεπτιδίων Μεταγωγής (Protein Transduction Domains, PTDs) με το IVT-mRNA, σχηματίζοντας το PTD-IVT-mRNA. Η τεχνολογία PTD χρησιμοποιεί μικρά σε μέγεθος πεπτίδια, ικανά να διαπεράσουν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες, μεταφέροντας ενδοκυτταρικά μια ποικιλία «φορτίων». Το παραγόμενο, με καλύπτρα και πολυ-(Α) ουρά IVT-mRNA μπορεί να συνδυαστεί με ένα επιλεγμένο PTD, προσφέροντας έτσι μια πλατφόρμα μεταφοράς για οποιοδήποτε πιθανό θεραπευτικό IVT-mRNA του ενδιαφέροντος και ως μια εναλλακτική προσέγγιση της Θεραπείας Πρωτεϊνικής. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της ικανότητας μεταγωγής και της μετάφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, το PTD-IVT-mRNA επιλέχθηκε να μελετηθεί σε δύο μοντέλα ασθενειών, στη β-θαλασσαιμία και σε μια πρωτογενή μιτοχονδριακή διαταραχή, τη θανάσιμη βρεφική καρδιοεγκεφαλομυοπάθεια και ανεπάρκεια της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX), λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο SCO2. Αρχικά, σχεδιάστηκαν και κλωνοποιήθηκαν οι πλασμιδιακοί φορείς, οι οποίοι αποτέλεσαν τα εκμαγεία για την in vitro μεταγραφή και οι οποίοι έφεραν την κωδική αλληλουχία, είτε του γονιδίου της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), της β-σφαιρίνης, είτε του γονιδίου SCO2. Ανοδικά και καθοδικά της εκάστοτε κωδικής αλληλουχίας κλωνοποιήθκαν οι αμετάφραστες περιοχές (UTRs): το 5′-UTR και το 3′-UTR, της ποντικίσιας και ανθρώπινης β- σφαιρίνης, αντίστοιχα, για σκοπούς μεγαλύτερης σταθερότητας του IVT-mRNA. Ακολούθως, το IVT-mRNA συζεύχθηκε με το επιλεγμένο PTD και η ανάλυση του PTD-IVT-mRNA, με φασματοσκοπία NMR, επιβεβαίωσε την επιτυχή σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA. Επιπλέον, στα πειράματα σταθερότητας, το PTD-IVT-mRNA έδειξε σημαντικά αυξημένη αντοχή και σχετικά καμία αποδόμηση, μετά από επώαση σε αντίξοες συνθήκες, με την παρουσία επιβλαβών RNασών, σε σχέση με το γυμνό IVT-mRNA. Στα πλαίσια προκαταρκτικών πειραμάτων, για την αξιολόγηση της καινοτόμου PTD-IVT-mRNA πλατφόρμας, έγινε εφαρμογή στο μοντέλο ανθρώπινων Κ-562 κυττάρων, με τη χρήση του IVT-mRNA της GFP, ως δείκτη της μεταγωγής και της πρωτεϊνικής έκφρασης. Ακολούθησαν, τα πειράματα επώασης του PTD-IVT-mRNA, τόσο της β-σφαιρίνης, όσο και του SCO2, στα Κ-562 κύτταρα και μελετήθηκε η ενδοκυττάρια μεταγωγή και η κινητική έκφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Ακολούθως, η αξιολόγηση του PTD-IVT- mRNA διεξήχθηκε σε κύτταρα μυελού των οστών από τρεις β-θαλασσαιμικούς ασθενείς αλλά και σε πρωτογενείς ινοβλάστες, προερχόμενους από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Είναι ενδιαφέρον ότι το PTD-IVT-mRNA εμφανίζει επίσης ενθαρρυντικά ποσοστά ενδοκυττάριας μεταγωγής και υψηλή αποτελεσματικότητα έκφρασης. Aκόμα, αποδείχθηκε η αναστροφή του φαινοτύπου, μέσω της αύξησης της λειτουργικότητας της COX, στην περίπτωση του PTD-IVT-mRNA του SCO2, στους ινοβλάστες, από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια υψηλή δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταγωγής του PTD-IVT-mRNA, αφού αντιμετωπίζει προβλήματα σταθερότητας, μεταγωγής και μετάφρασης των IVT-mRNA, υποδηλώνοντας ότι το σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια Θεραπείας Πρωτεϊνικής Αντικατάστασης, τόσο σε μονογονιδιακές, αλλά και σε μιτοχονδριακές-μεταβολικές διαταραχές.

scholarly journals Protein Transduction Domains Fused to Virus Receptors Improve Cellular Virus Uptake and Enhance Oncolysis by Tumor-Specific Replicating Vectors

2004 ◽  
Vol 78 (24) ◽  
pp. 13743-13754 ◽  
Author(s):  
Florian Kühnel ◽  
Bernd Schulte ◽  
Thomas Wirth ◽  
Norman Woller ◽  
Sonja Schäfers ◽  
...  
Keyword(s):  
Viral Vectors ◽  
Protein Transduction ◽  
Virus Binding ◽  
Adenoviral Infection ◽  
Protein Transduction Domains ◽  
Oncolytic Therapy ◽  
Uptake Rates ◽  
Immunodeficiency Virus ◽  
Transactivator Of Transcription ◽  
Adenovirus Receptor

ABSTRACT Expression of cellular receptors determines viral tropism and limits gene delivery by viral vectors. Protein transduction domains (PTDs) have been shown to deliver proteins, antisense oligonucleotides, liposomes, or plasmid DNA into cells. In our study, we investigated the role of several PTD motifs in adenoviral infection. When physiologically expressed, a PTD from human immunodeficiency virus transactivator of transcription (Tat) did not improve adenoviral infection. We therefore fused PTDs to the ectodomain of the coxsackievirus-adenovirus receptor (CARex) to attach PTDs to adenoviral fiber knobs. CARex-Tat and CARex-VP22 allowed efficient adenoviral infection in nonpermissive cells and significantly improved viral uptake rates in permissive cells. Dose-dependent competition of CARex-PTD-mediated infection using CARex and inhibition experiments with heparin showed that binding of CARex-PTD to both adenoviral fiber and cellular glycosaminoglycans is essential for the improvement of infection. CARex-PTD-treated adenoviruses retained their properties after density gradient ultracentrifugation, indicating stable binding of CARex-PTD to adenoviral particles. Consequently, the mechanism of CARex-PTD-mediated infection involves coating of the viral fiber knobs by CARex-PTD, rather than placement of CARex domains on cell surfaces. Expression of CARex-PTDs led to enhanced lysis of permissive and nonpermissive tumor cells by replicating adenoviruses, indicating that CARex-PTDs are valuable tools to improve the efficacy of oncolytic therapy. Together, our study shows that CARex-PTDs facilitate gene transfer in nonpermissive cells and improve viral uptake at reduced titers and infection times. The data suggest that PTDs fused to virus binding receptors may be a valuable tool to overcome natural tropism of vectors and could be of great interest for gene therapeutic approaches.

scholarly journals Enhanced skin penetration of P20 phosphopeptide using protein transduction domains

2008 ◽  
Vol 68 (2) ◽  
pp. 441-445 ◽  
Author(s):  
Luciana B. Lopes ◽  
Elizabeth Furnish ◽  
Padmini Komalavilas ◽  
Brandon L. Seal ◽  
Alyssa Panitch ◽  
...  
Keyword(s):  
Skin Penetration ◽  
Protein Transduction ◽  
Protein Transduction Domains

Taking the Cell by Stealth or Storm? Protein Transduction Domains (PTDs) as Versatile Vectors for Delivery

2002 ◽  
Vol 21 (12) ◽  
pp. 879-894 ◽  
Author(s):  
Marie A. Bogoyevitch ◽  
Tulene S. Kendrick ◽  
Dominic C.H. Ng ◽  
Renae K. Barr
Keyword(s):  
Protein Transduction ◽  
Protein Transduction Domains

Increased Engraftment of Hepatic Progenitors After Activation of the Hepatocyte Growth Factor Signaling Pathway by Protein Transduction

2009 ◽  
Vol 234 (9) ◽  
pp. 1102-1108 ◽  
Author(s):  
Guillaume Kellermann ◽  
Lyes Boudechiche ◽  
Anne Weber ◽  
Michelle Hadchouel
Keyword(s):  
Growth Factor ◽  
Hepatocyte Growth Factor ◽  
Signaling Pathway ◽  
Cell Types ◽  
Cell Surface Receptor ◽  
Migration And Invasion ◽  
Protein Transduction ◽  
Growth Factor Signaling ◽  
Hepatocyte Growth

Cell transplantation has become a major focus in biomedical research. However, efficient engraftment in solid tissues remains a challenge. Hepatocyte growth factor (HGF) signaling increases survival, proliferation, migration, and invasion of many cell types through Met, its cell surface receptor. Therefore, activation of this signaling pathway may improve the ability of many cells to be transplanted. We constructed a constitutively activated form of Met (Tpr-Met) fused to the protein transduction domain of HIV-TAT to activate the HGF/Met pathway for a few hours following cell injection. Matrix-assisted refolding was used to renature TAT-Tpr-Met protein, which was efficiently delivered into cells and recapitulated several biological functions of Met in vitro. Furthermore, treatment of hepatic progenitors with this molecule for one hour before transplantation significantly improved engraftment efficiency (31% untreated cells, 58% treated cells). These findings suggest that the transient transfer of Tpr-Met may provide a new approach to increase the proportion of successfully engrafted cells.

scholarly journals TAT-Mediated Neurogenin 3 Protein Transduction Stimulates Pancreatic Endocrine Differentiation In Vitro

Diabetes ◽  
2005 ◽  
Vol 54 (3) ◽  
pp. 720-726 ◽  
Author(s):  
J. Dominguez-Bendala ◽  
D. Klein ◽  
M. Ribeiro ◽  
C. Ricordi ◽  
L. Inverardi ◽  
...  
Keyword(s):  
Protein Transduction ◽  
Neurogenin 3 ◽  
Endocrine Differentiation

scholarly journals A ubiquitin-based assay for the cytosolic uptake of protein transduction domains

2005 ◽  
Vol 11 (2) ◽  
pp. 205-214 ◽  
Author(s):  
Fabien Loison ◽  
Philippe Nizard ◽  
Tony Sourisseau ◽  
Pascale Le Goff ◽  
Laure Debure ◽  
...  
Keyword(s):  
Protein Transduction ◽  
Protein Transduction Domains

scholarly journals Controversial Regulation of Gene Expression and Protein Transduction of Aquaporins under Drought and Salinity Stress

Plants ◽  
2020 ◽  
Vol 9 (12) ◽  
pp. 1662
Author(s):  
Lucía Yepes-Molina ◽  
Gloria Bárzana ◽  
Micaela Carvajal
Keyword(s):  
Plasma Membrane ◽  
Messenger Rna ◽  
Regulation Of Gene Expression ◽  
Protein Transduction ◽  
Mrna Synthesis ◽  
Plasma Membrane Intrinsic Protein ◽  
Entire Plant ◽  
The One

Enhancement of the passage of water through membranes is one of the main mechanisms via which cells can maintain their homeostasis under stress conditions, and aquaporins are the main participants in this process. However, in the last few years, a number of studies have reported discrepancies between aquaporin messenger RNA (mRNA) expression and the number of aquaporin proteins synthesised in response to abiotic stress. These observations suggest the existence of post-transcriptional mechanisms which regulate plasma membrane intrinsic protein (PIP) trafficking to the plasma membrane. This indicates that the mRNA synthesis of some aquaporins could be modulated by the accumulation of the corresponding encoded protein, in relation to the turnover of the membranes. This aspect is discussed in terms of the results obtained: on the one hand, with isolated vesicles, in which the level of proteins present provides the membranes with important characteristics such as resistance and stability and, on the other, with isolated proteins reconstituted in artificial liposomes as an in vitro method to address the in vivo physiology of the entire plant.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document