Inactivation of HIV-1 in Polarized Infant Tonsil Epithelial Cells by Human Beta-Defensins 2 and 3 Tagged with the Protein Transduction Domain of HIV-1 Tat

Mother-to-child transmission (MTCT) of HIV-1 may occur during pregnancy, labor, and breastfeeding; however, the molecular mechanism of MTCT of virus remains poorly understood. Infant tonsil mucosal epithelium may sequester HIV-1, serving as a transient reservoir, and may play a critical role in MTCT. Innate immune proteins human beta-defensins 2 (hBD-2) and -3 may inactivate intravesicular virions. To establish delivery of hBD-2 and -3 into vesicles containing HIV-1, we tagged hBDs with the protein transduction domain (PTD) of HIV-1 Tat, which facilitates an efficient translocation of proteins across cell membranes. Our new findings showed that hBD-2 and -3 proteins tagged with PTD efficiently penetrated polarized tonsil epithelial cells by endocytosis and direct penetration. PTD-initiated internalization of hBD-2 and -3 proteins into epithelial cells led to their subsequent penetration of multivesicular bodies (MVB) and vacuoles containing HIV-1. Furthermore, PTD played a role in the fusion of vesicles containing HIV-1 with lysosomes, where virus was inactivated. PTD-initiated internalization of hBD-2 and -3 proteins into ex vivo tonsil tissue explants reduced the spread of virus from epithelial cells to CD4+ T lymphocytes, CD68+ macrophages, and CD1c+ dendritic cells, suggesting that this approach may serve as an antiviral strategy for inactivating intraepithelial HIV-1 and reducing viral MTCT.

TAT-Conjugated NDUFS8 Can Be Transduced into Mitochondria in a Membrane-Potential-Independent Manner and Rescue Complex I Deficiency

NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 8 (NDUFS8) is a nuclear-encoded core subunit of human mitochondrial complex I. Defects in NDUFS8 are associated with Leigh syndrome and encephalomyopathy. Cell-penetrating peptide derived from the HIV-1 transactivator of transcription protein (TAT) has been successfully applied as a carrier to bring fusion proteins into cells without compromising the biological function of the cargoes. In this study, we developed a TAT-mediated protein transduction system to rescue complex I deficiency caused by NDUFS8 defects. Two fusion proteins (TAT-NDUFS8 and NDUFS8-TAT) were exogenously expressed and purified from Escherichia coli for transduction of human cells. In addition, similar constructs were generated and used in transfection studies for comparison. The results showed that both exogenous TAT-NDUFS8 and NDUFS8-TAT were delivered into mitochondria and correctly processed. Interestingly, the mitochondrial import of TAT-containing NDUFS8 was independent of mitochondrial membrane potential. Treatment with TAT-NDUFS8 not only significantly improved the assembly of complex I in an NDUFS8-deficient cell line, but also partially rescued complex I functions both in the in-gel activity assay and the oxygen consumption assay. Our current findings suggest the considerable potential of applying the TAT-mediated protein transduction system for treatment of complex I deficiency.

Ανάπτυξη mRNA μορίων στη θεραπευτική προσέγγιση μεταβολικών/μονογονιδιακών νοσημάτων με την αξιοποίηση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγτής (PTDs/CPPs)

Το in vitro μεταγραφόμενο (in vitro transcribed, IVT)-mRNA μοιάζει με το φυσικό mRNA και η επιτυχής ενδοκυττάρια μεταφορά του, επιτρέπει την παροδική έκφραση της αντίστοιχης εξωγενούς πρωτεΐνης, από τον ίδιο το μεταφραστικό μηχανισμό των κυττάρων. Το ισχυρότερο πλεονέκτημα της τεχνολογίας IVT-mRNA είναι ότι τα μόρια mRNA δεν παρεμβαίνουν στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η επιτυχημένη εφαρμογή του IVT-mRNA βασίζεται στην ανάπτυξη ασφαλούς και αποτελεσματικής μεταφοράς, η οποία παραμένει ακόμα μια πρόκληση. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή σχεδιάστηκε ως πλατφόρμα μεταφοράς, μια καινοτόμος μεθοδολογία για το συνδυασμό της τεχνολογίας των Πεπτιδίων Μεταγωγής (Protein Transduction Domains, PTDs) με το IVT-mRNA, σχηματίζοντας το PTD-IVT-mRNA. Η τεχνολογία PTD χρησιμοποιεί μικρά σε μέγεθος πεπτίδια, ικανά να διαπεράσουν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες, μεταφέροντας ενδοκυτταρικά μια ποικιλία «φορτίων». Το παραγόμενο, με καλύπτρα και πολυ-(Α) ουρά IVT-mRNA μπορεί να συνδυαστεί με ένα επιλεγμένο PTD, προσφέροντας έτσι μια πλατφόρμα μεταφοράς για οποιοδήποτε πιθανό θεραπευτικό IVT-mRNA του ενδιαφέροντος και ως μια εναλλακτική προσέγγιση της Θεραπείας Πρωτεϊνικής. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της ικανότητας μεταγωγής και της μετάφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, το PTD-IVT-mRNA επιλέχθηκε να μελετηθεί σε δύο μοντέλα ασθενειών, στη β-θαλασσαιμία και σε μια πρωτογενή μιτοχονδριακή διαταραχή, τη θανάσιμη βρεφική καρδιοεγκεφαλομυοπάθεια και ανεπάρκεια της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX), λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο SCO2. Αρχικά, σχεδιάστηκαν και κλωνοποιήθηκαν οι πλασμιδιακοί φορείς, οι οποίοι αποτέλεσαν τα εκμαγεία για την in vitro μεταγραφή και οι οποίοι έφεραν την κωδική αλληλουχία, είτε του γονιδίου της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), της β-σφαιρίνης, είτε του γονιδίου SCO2. Ανοδικά και καθοδικά της εκάστοτε κωδικής αλληλουχίας κλωνοποιήθκαν οι αμετάφραστες περιοχές (UTRs): το 5′-UTR και το 3′-UTR, της ποντικίσιας και ανθρώπινης β- σφαιρίνης, αντίστοιχα, για σκοπούς μεγαλύτερης σταθερότητας του IVT-mRNA. Ακολούθως, το IVT-mRNA συζεύχθηκε με το επιλεγμένο PTD και η ανάλυση του PTD-IVT-mRNA, με φασματοσκοπία NMR, επιβεβαίωσε την επιτυχή σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA. Επιπλέον, στα πειράματα σταθερότητας, το PTD-IVT-mRNA έδειξε σημαντικά αυξημένη αντοχή και σχετικά καμία αποδόμηση, μετά από επώαση σε αντίξοες συνθήκες, με την παρουσία επιβλαβών RNασών, σε σχέση με το γυμνό IVT-mRNA. Στα πλαίσια προκαταρκτικών πειραμάτων, για την αξιολόγηση της καινοτόμου PTD-IVT-mRNA πλατφόρμας, έγινε εφαρμογή στο μοντέλο ανθρώπινων Κ-562 κυττάρων, με τη χρήση του IVT-mRNA της GFP, ως δείκτη της μεταγωγής και της πρωτεϊνικής έκφρασης. Ακολούθησαν, τα πειράματα επώασης του PTD-IVT-mRNA, τόσο της β-σφαιρίνης, όσο και του SCO2, στα Κ-562 κύτταρα και μελετήθηκε η ενδοκυττάρια μεταγωγή και η κινητική έκφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Ακολούθως, η αξιολόγηση του PTD-IVT- mRNA διεξήχθηκε σε κύτταρα μυελού των οστών από τρεις β-θαλασσαιμικούς ασθενείς αλλά και σε πρωτογενείς ινοβλάστες, προερχόμενους από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Είναι ενδιαφέρον ότι το PTD-IVT-mRNA εμφανίζει επίσης ενθαρρυντικά ποσοστά ενδοκυττάριας μεταγωγής και υψηλή αποτελεσματικότητα έκφρασης. Aκόμα, αποδείχθηκε η αναστροφή του φαινοτύπου, μέσω της αύξησης της λειτουργικότητας της COX, στην περίπτωση του PTD-IVT-mRNA του SCO2, στους ινοβλάστες, από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια υψηλή δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταγωγής του PTD-IVT-mRNA, αφού αντιμετωπίζει προβλήματα σταθερότητας, μεταγωγής και μετάφρασης των IVT-mRNA, υποδηλώνοντας ότι το σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια Θεραπείας Πρωτεϊνικής Αντικατάστασης, τόσο σε μονογονιδιακές, αλλά και σε μιτοχονδριακές-μεταβολικές διαταραχές.

Controversial Regulation of Gene Expression and Protein Transduction of Aquaporins under Drought and Salinity Stress

Enhancement of the passage of water through membranes is one of the main mechanisms via which cells can maintain their homeostasis under stress conditions, and aquaporins are the main participants in this process. However, in the last few years, a number of studies have reported discrepancies between aquaporin messenger RNA (mRNA) expression and the number of aquaporin proteins synthesised in response to abiotic stress. These observations suggest the existence of post-transcriptional mechanisms which regulate plasma membrane intrinsic protein (PIP) trafficking to the plasma membrane. This indicates that the mRNA synthesis of some aquaporins could be modulated by the accumulation of the corresponding encoded protein, in relation to the turnover of the membranes. This aspect is discussed in terms of the results obtained: on the one hand, with isolated vesicles, in which the level of proteins present provides the membranes with important characteristics such as resistance and stability and, on the other, with isolated proteins reconstituted in artificial liposomes as an in vitro method to address the in vivo physiology of the entire plant.

Micellized Protein Transduction Domain-Bone Morphogenetic Protein-7 Efficiently Blocks Renal Fibrosis Via Inhibition of Transforming Growth Factor-Beta–Mediated Epithelial–Mesenchymal Transition

Tubulointerstitial renal fibrosis is a chronic disease process affecting chronic kidney disease (CKD). While the etiological role of transforming growth factor-beta (TGF-β) is well known for epithelial–mesenchymal transition (EMT) in chronic kidney disease, effective therapeutics for renal fibrosis are largely limited. As a member of the TGF-β superfamily, bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) plays an important role as an endogenous antagonist of TGF-β, inhibiting fibrotic progression in many organs. However, soluble rhBMP-7 is hardly available for therapeutics due to its limited pharmacodynamic profile and rapid clearance in clinical settings. In this study, we have developed a novel therapeutic approach with protein transduction domain (PTD) fused BMP-7 in micelle (mPTD-BMP-7) for long-range signaling in vivo. Contrary to rhBMP-7 targeting its cognate receptors, the nano-sized mPTD-BMP-7 is transduced into cells through an endosomal pathway and secreted to the exosome having active BMP-7. Further, transduced mPTD-BMP-7 successfully activates SMAD1/5/8 and inhibits the TGF-β–mediated epithelial–mesenchymal transition process in vitro and in an in vivo unilateral ureter obstruction model. To determine the clinical relevance of our strategy, we also developed an intra-arterial administration of mPTD-BMP-7 through renal artery in pigs. Interestingly, mPTD-BMP-7 through renal artery intervention effectively delivered into Bowman’s space and inhibits unilateral ureter obstruction–induced renal fibrosis in pigs. Our results provide a novel therapeutic targeting TGF-β–mediated renal fibrosis and other organs as well as a clinically available approach for kidney.