Ανάπτυξη mRNA μορίων στη θεραπευτική προσέγγιση μεταβολικών/μονογονιδιακών νοσημάτων με την αξιοποίηση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγτής (PTDs/CPPs)

Το in vitro μεταγραφόμενο (in vitro transcribed, IVT)-mRNA μοιάζει με το φυσικό mRNA και η επιτυχής ενδοκυττάρια μεταφορά του, επιτρέπει την παροδική έκφραση της αντίστοιχης εξωγενούς πρωτεΐνης, από τον ίδιο το μεταφραστικό μηχανισμό των κυττάρων. Το ισχυρότερο πλεονέκτημα της τεχνολογίας IVT-mRNA είναι ότι τα μόρια mRNA δεν παρεμβαίνουν στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η επιτυχημένη εφαρμογή του IVT-mRNA βασίζεται στην ανάπτυξη ασφαλούς και αποτελεσματικής μεταφοράς, η οποία παραμένει ακόμα μια πρόκληση. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή σχεδιάστηκε ως πλατφόρμα μεταφοράς, μια καινοτόμος μεθοδολογία για το συνδυασμό της τεχνολογίας των Πεπτιδίων Μεταγωγής (Protein Transduction Domains, PTDs) με το IVT-mRNA, σχηματίζοντας το PTD-IVT-mRNA. Η τεχνολογία PTD χρησιμοποιεί μικρά σε μέγεθος πεπτίδια, ικανά να διαπεράσουν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες, μεταφέροντας ενδοκυτταρικά μια ποικιλία «φορτίων». Το παραγόμενο, με καλύπτρα και πολυ-(Α) ουρά IVT-mRNA μπορεί να συνδυαστεί με ένα επιλεγμένο PTD, προσφέροντας έτσι μια πλατφόρμα μεταφοράς για οποιοδήποτε πιθανό θεραπευτικό IVT-mRNA του ενδιαφέροντος και ως μια εναλλακτική προσέγγιση της Θεραπείας Πρωτεϊνικής. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της ικανότητας μεταγωγής και της μετάφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, το PTD-IVT-mRNA επιλέχθηκε να μελετηθεί σε δύο μοντέλα ασθενειών, στη β-θαλασσαιμία και σε μια πρωτογενή μιτοχονδριακή διαταραχή, τη θανάσιμη βρεφική καρδιοεγκεφαλομυοπάθεια και ανεπάρκεια της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX), λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο SCO2. Αρχικά, σχεδιάστηκαν και κλωνοποιήθηκαν οι πλασμιδιακοί φορείς, οι οποίοι αποτέλεσαν τα εκμαγεία για την in vitro μεταγραφή και οι οποίοι έφεραν την κωδική αλληλουχία, είτε του γονιδίου της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), της β-σφαιρίνης, είτε του γονιδίου SCO2. Ανοδικά και καθοδικά της εκάστοτε κωδικής αλληλουχίας κλωνοποιήθκαν οι αμετάφραστες περιοχές (UTRs): το 5′-UTR και το 3′-UTR, της ποντικίσιας και ανθρώπινης β- σφαιρίνης, αντίστοιχα, για σκοπούς μεγαλύτερης σταθερότητας του IVT-mRNA. Ακολούθως, το IVT-mRNA συζεύχθηκε με το επιλεγμένο PTD και η ανάλυση του PTD-IVT-mRNA, με φασματοσκοπία NMR, επιβεβαίωσε την επιτυχή σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA. Επιπλέον, στα πειράματα σταθερότητας, το PTD-IVT-mRNA έδειξε σημαντικά αυξημένη αντοχή και σχετικά καμία αποδόμηση, μετά από επώαση σε αντίξοες συνθήκες, με την παρουσία επιβλαβών RNασών, σε σχέση με το γυμνό IVT-mRNA. Στα πλαίσια προκαταρκτικών πειραμάτων, για την αξιολόγηση της καινοτόμου PTD-IVT-mRNA πλατφόρμας, έγινε εφαρμογή στο μοντέλο ανθρώπινων Κ-562 κυττάρων, με τη χρήση του IVT-mRNA της GFP, ως δείκτη της μεταγωγής και της πρωτεϊνικής έκφρασης. Ακολούθησαν, τα πειράματα επώασης του PTD-IVT-mRNA, τόσο της β-σφαιρίνης, όσο και του SCO2, στα Κ-562 κύτταρα και μελετήθηκε η ενδοκυττάρια μεταγωγή και η κινητική έκφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Ακολούθως, η αξιολόγηση του PTD-IVT- mRNA διεξήχθηκε σε κύτταρα μυελού των οστών από τρεις β-θαλασσαιμικούς ασθενείς αλλά και σε πρωτογενείς ινοβλάστες, προερχόμενους από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Είναι ενδιαφέρον ότι το PTD-IVT-mRNA εμφανίζει επίσης ενθαρρυντικά ποσοστά ενδοκυττάριας μεταγωγής και υψηλή αποτελεσματικότητα έκφρασης. Aκόμα, αποδείχθηκε η αναστροφή του φαινοτύπου, μέσω της αύξησης της λειτουργικότητας της COX, στην περίπτωση του PTD-IVT-mRNA του SCO2, στους ινοβλάστες, από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια υψηλή δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταγωγής του PTD-IVT-mRNA, αφού αντιμετωπίζει προβλήματα σταθερότητας, μεταγωγής και μετάφρασης των IVT-mRNA, υποδηλώνοντας ότι το σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια Θεραπείας Πρωτεϊνικής Αντικατάστασης, τόσο σε μονογονιδιακές, αλλά και σε μιτοχονδριακές-μεταβολικές διαταραχές.

The Aggregation Inhibitor Peptide QBP1 as a Therapeutic Molecule for the Polyglutamine Neurodegenerative Diseases

Misfolding and abnormal aggregation of proteins in the brain are implicated in the pathogenesis of various neurodegenerative diseases including Alzheimer's, Parkinson's, and the polyglutamine (polyQ) diseases. In the polyQ diseases, an abnormally expanded polyQ stretch triggers misfolding and aggregation of the disease-causing proteins, eventually resulting in neurodegeneration. In this paper, we introduce our therapeutic strategy against the polyQ diseases using polyQ binding peptide 1 (QBP1), a peptide that we identified by phage display screening. We showed that QBP1 specifically binds to the expanded polyQ stretch and inhibits its misfolding and aggregation, resulting in suppression of neurodegeneration in cell culture and animal models of the polyQ diseases. We further demonstrated the potential of protein transduction domains (PTDs) for in vivo delivery of QBP1. We hope that in the near future, chemical analogues of aggregation inhibitor peptides including QBP1 will be developed against protein misfolding-associated neurodegenerative diseases.