Genomic engineering of adipocytes with CRISPR/Cas9 delivery particles for ex vivo therapeutic approach for type 2 diabetes

Η παχυσαρκία και ο διαβήτης τύπου 2 (ΔΤ2) σχετίζονται με διαταραχές στην ομοιόσταση της γλυκόζης και των λιπιδίων η οποία ρυθμίζεται από την ινσουλίνη και προκαλεί σοβαρές επιπλοκές συμπεριλαμβανομένων καρδιαγγειακών νοσημάτων και στεατοηπατίτιδας. Ο συστημικός μεταβολισμός της γλυκόζης ρυθμίζεται από τους διακριτούς λιπώδεις ιστούς (fat depots), στις οποίες συμπεριλαμβάνονται δύο κυρίως τύποι λιπώδους ιστού το λευκό λίπος και το φαιό (ή καφέ) λίπος. Το μεν λευκό λίπος αποτελείται από τα «λευκά» λιποκύτταρα και έχει ρόλο αποθήκευσης της ενέργειας σε μορφή λιπιδίων ενώ το φαιό λίπος αποτελείται από τα «φαιά» και «μπεζ» λιποκύτταρα. Tα κύτταρα αυτά καταναλώνουν την αποθηκευμένη ενέργεια για την παραγωγή θερμότητας και εκφράζουν την πρωτεΐνη αποσύζευξης 1 (UCP1) καθώς και πλήθος εκκρινόμενων παραγόντων που ευνοούν τον μεταβολισμό. Έχει περιγραφή στη βιβλιογραφία ότι η μεταμόσχευση φαιού λιπώδους ιστού ή ποντικίσιων ή αθανατοποιημένων ανθρώπινων φαιών λιποκυττάρων σε παχύσαρκους μύες βελτιώνει την ανοχή στη γλυκόζη. Ωστόσο, η εφαρμογή μιας ανάλογης θεραπευτικής παρέμβασης στον άνθρωπο δεν έχει καταστεί δυνατή καθώς η διαθεσιμότητα των πρωτογενών ανθρώπινων φαιών/μπεζ λιποκυττάρων είναι εξαιρετικά περιορισμένη. Στην παρούσα διατριβή, χρησιμοποίησα μεθόδους πολλαπλασιασμού σε μεγάλη κλίματα ανθρώπινων πρόγονων λιποκυττάρων από εξαιρετικά μικρά δείγματα ανθρώπινου λιπώδους ιστού. Στα ανθρώπινα πρόδρομα λιποκύτταρα, παράλληλα με τα ποντικίσια, εφάρμοσα τροποποίηση του γονιδιώματος με τη χρήση ομαδοποιημένων με τακτά μεσοδιαστήματα σύντομων παλινδρομικών μοτίβων (CRISPR). O στόχος αυτής της γονιδιακής τροποποίησης είναι να απενεργοποιήσει γονίδια που φυσιολογικά παρεμποδίζουν τη μετατροπή των λιποκυττάρων από λευκά σε φαιά. Συνεπώς, η απώλεια της λειτουργικότητας αυτών των γονιδίων αναμένεται να προκαλέσει την μετατροπή των λευκών λιποκυττάρων σε φαιά που είναι ωφέλιμα για τον μεταβολισμό της γλυκόζης. Σημαντικοί δευτερεύοντες στόχοι της στρατηγικής της θεραπείας είναι η παράκαμψη της ανοσογονικότητας των συστατικών CRISPR και της γονιδιακής τροποποίησης σε ανεπιθύμητους ιστούς καθώς και η ελαχιστοποίηση της ανεπιθύμητης τροποποίησης σε περιοχές του γονιδιώματος εκτός των στοχευμένων. Στην παρούσα εργασία, ανέπτυξα και μεγιστοποίησα τη μέθοδο ex vivo μεταφοράς στα κύτταρα – στόχους (λιποκύτταρα) των συμπλεγμάτων στρεπτοκοκκικού Cas9 ενζύμου και στου οδηγού sgRNA, ούτως ώστε να επιτυγχάνεται η ταχύτατη διάσπασή τους αμέσως μετά την τροποποίηση του γονιδίου – στόχο. Για τη μεταφορά των συμπλεγμάτων αυτών, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ηλεκτροδιάτρησης με αποτελεσματικότητα τροποποίησης που πλησιάζει το 100%. Κατόπιν ελέγχου πλήθους υποψηφίων γονιδίων – στόχων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία, εντοπίστηκε ως ο πλέον υποσχόμενος στόχος το γονίδιο της πρωτεΐνης 1 που αναγνωρίζει πυρηνικούς υποδοχείς (NRIP1). Τα λιποκύτταρα στα οποία απενεργοποιήθηκε το Nrip1 γονίδιο (NRIP1 Knock-out, NRIP1KO) επάγουν την έκφραση ενός «φαιού» γονιδιακού προφίλ το οποίο συμπεριλαμβάνει την πρωτεΐνη UCP1 και ορισμένους εκκρινόμενους παράγοντες. Στη συνέχεια, χαρακτήρισα in vitro το φαινότυπο των τροποποιημένων κυττάρων με πλήθος δοκιμασιών όπως έκφραση γνωστών γονιδίων που σχετίζονται με τη θερμογένεση, μιτοχονδριακή αναπνοή, οξέωση λιπιδίων, εκκρινομένους παράγοντες, δοκιμασία κατανάλωση οξυγόνου, έκφραση της πρωτεΐνης UCP1, τόσο στο ποντικίσια όσο και στο ανθρώπινα κύτταρα. Τέλος, τα βελτιστοποιημένα με CRISPR ποντικίσια ή ανθρώπινα «φαιά» λιποκύτταρα εμφυτεύθηκαν σε ποντίκια – λήπτες τα οποία λάμβαναν διατροφή εμπλουτισμένη σε λίπος για την πρόκληση διαβήτη τύπου 2. Τα εμφυτεύματα των τροποποιημένων κυττάρων έδειξαν μικρότερη συσσώρευση σωματικού λίπους μικρότερη συσσώρευση τριγλυκεριδίων στο ηπατικό παρέγχυμα καθώς επίσης βελτίωσαν την ανοχή στη γλυκόζη συγκριτικά με τα ποντίκια – μάρτυρες που έλαβαν εμφυτεύματα μη τροποποιημένων λιποκυττάρων. Παράλληλα, όπως απεδείχθη η παρουσία των συστατικών της CRISPR τροποποίησης ήταν παροδική στα κύτταρα-στόχους καθώς η ενδονουκλεάση Cas9 αποδομείται και δεν είναι ανιχνεύσιμη με ηλεκτροφόρηση ολικής πρωτεΐνης πριν τις εμφυτεύσεις. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν μια θεραπευτική στρατηγική για τη βελτίωση της ομοιόστασης του μεταβολισμού μέσω της γονιδιακής τροποποίησης με CRISPR ανθρώπινων λιποκυττάρων χωρίς την έκθεση του ασθενούς στα ανοσογόνα και δυνητικά επιβλαβή ένζυμο Cas9 και οδηγό sgRNA και άλλων οχημάτων μεταφοράς των συστατικών CRISPR.