scholarly journals Mapping the lipid metabolites in follicular fluid from patients with infertility issues across ages

2020 ◽  
Author(s):  
Xingxing Zhang ◽  
Tianqi Wang ◽  
Jingyan Song ◽  
Jifeng Deng ◽  
Zhengao Sun

Abstract Background: Follicular fluid is an important external environment for the growth and development of oocytes. A thorough identification of specific components in follicular fluid can better the existing understand of intracellular signal transduction and reveal potential biomarkers of oocyte health in women undergoing assisted reproductive therapy. To study the biomarkers that affect the development of oocytes, we have adopted a new method of SWATH to MRM( the sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra to multiple reaction monitor)metabolomics to provide extensive coverage and excellent quantitative data. This was done to investigate the differences in follicular fluid of patients undergoing in vitro fertilization (IVF) and embryo transfer in different age groups and to further explore the relationship between follicular fluid, age and reproductive function.Method: A combination of Ultra-high-performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry techniques were used to analyze the follicular fluid of 230 patients enrolled for the IVF cycle. The patients were of different ages grouped into two groups:the younger and older patients.The obtained multidimensional chromatographic data were processed by principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). The charge ratios and mass numbers enabled for the identification of different fragments in the samples. Matching information obtained through database search and the fragment information obtained by fragment ion scan structurally identified substances in the samples. This was used to determine the differential compounds.Results: The quality and quantity of oocytes decline with age. This in caused by changes in follicular fluid metabolites. The main differences were in lipid metabolites. Some were up-regulated : Arachidonate, LysoPC(16:1), LysoPC(20:4) and LysoPC(20:3) while others were down-regulated: LysoPC(18:3) and LysoPC(18:1).Conclusions: Metabolomic analysis of follicular fluid revealed that with the increase in age, several differential metabolites are at play. Among these metabolites, lipid metabolism undergoes significant changes that affect the development of oocytes thus causing reduced fertility in older women. These differential metabolites related to follicular development may provide possible detection and treatment targets for promoting oocyte health, and provide scientific basis for understanding the environment of oocyte development.

2020 ◽  
Author(s):  
xingxing zhang ◽  
tianqi wang ◽  
jingyan song ◽  
jifeng deng ◽  
Zhengao Sun

Abstract Background: Follicular fluid is an important external environment for the growth and development of oocytes. A thorough identification of specific components in follicular fluid can better the existing understand of intracellular signal transduction and reveal potential biomarkers of oocyte health in women undergoing assisted reproductive therapy. To study on follicular fluid metabolomics components at different ages based on lipid metabolism, we have adopted a new method of SWATH to MRM( the sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra to multiple reaction monitor)metabolomics to provide extensive coverage and excellent quantitative data. This was done to investigate the differences in follicular fluid of patients undergoing in vitro fertilization (IVF) and embryo transfer in different age groups and to further explore the relationship between follicular fluid, age and reproductive function.Method: A combination of Ultra-high-performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry techniques were used to analyze the follicular fluid of 230 patients enrolled for the IVF cycle. The patients were of different ages grouped into two groups:the younger and older patients.The obtained multidimensional chromatographic data were processed by principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). The charge ratios and mass numbers enabled for the identification of different fragments in the samples. Matching information obtained through database search and the fragment information obtained by fragment ion scan structurally identified substances in the samples. This was used to determine the differential compounds.Results:The quality of oocytes decline with age,and the lipid composition in follicular fluid also changes,The lipid metabolism that changes with age may be related to the quality of oocytes.The main differences were in lipid metabolites. Some were up-regulated : Arachidonate, LysoPC(16:1), LysoPC(20:4) and LysoPC(20:3) while others were down-regulated: LysoPC(18:3) and LysoPC(18:1).Conclusions: Metabolomic analysis of follicular fluid revealed that with the increase in age, several differential metabolites are at play. Among these metabolites, lipid metabolism undergoes significant changes that affect the development of oocytes thus causing reduced fertility in older women. These differential metabolites related to follicular development may provide possible detection and treatment targets for promoting oocyte health, and provide scientific basis for understanding the environment of oocyte development.


Biomolecules ◽  
2020 ◽  
Vol 10 (8) ◽  
pp. 1135
Author(s):  
Albert Batushansky ◽  
Anish Zacharia ◽  
Alaa Shehadeh ◽  
Reut Bruck-Haimson ◽  
Daniel Saidemberg ◽  
...  

Follicular fluid (FF) constitutes the microenvironment of the developing oocyte. We recently characterized its lipid composition and found lipid signatures of positive pregnancy outcome after in vitro fertilization (IVF). In the current study, we aimed to test the hypothesis that unexplained female infertility is related to lipid metabolism, given the lipid signature of positive-outcome IVF patients we previously found. Assuming that FF samples from IVF patients with male factor infertility can represent a non-hindered metabolic microenvironment, we compared them to FF taken from women with unexplained infertility. FF from patients undergoing IVF was examined for its lipid composition. We found highly increased triacylglycerol levels, with a lower abundance of monoacylglycerols, phospholipids and sphingolipids in the FF of patients with unexplained infertility. The alterations in the lipid class accumulation were independent of the body mass index (BMI) and were altogether kept across the age groups. Potential lipid biomarkers for pregnancy outcomes showed a highly discriminative abundance in the FF of unexplained infertility patients. Lipid abundance distinguished IVF patients with unrecognized infertility and provided a potential means for the evaluation of female fertility.


GYNECOLOGY ◽  
2020 ◽  
Vol 22 (1) ◽  
pp. 38-44
Author(s):  
Anna G. Burduli ◽  
Natalia A. Kitsilovskaya ◽  
Yuliya V. Sukhova ◽  
Irina A. Vedikhina ◽  
Tatiana Yu. Ivanets ◽  
...  

Aim. To assess the possibility of using androstenedione levels in blood serum and follicular fluid to predict ovarian response in assisted reproductive technology programs and to conduct a comparative analysis of the results obtained by 2 methods chemiluminescent immunoassay (CLIA) and high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Materials and methods. A prospective study included 55 couples who received in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer program therapy. The patients were divided into 3 groups depending on the ovarian response to stimulation: 1st (13 oocytes, n=4), 2nd (49 oocytes, n=27), 3rd (over 10 oocytes, n=24). Androstenedione levels were measured in blood serum obtained on the day of transvaginal ovarian puncture and in follicular fluid samples with CLIA and HPLC-MS/ MS methods at the laboratories of Kulakov National Medical Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology. Results. On the day of transvaginal ovarian puncture, the serum androstenedione levels, which were measured by HPLC-MS/MS, were increasing with an increase of the number of oocytes obtained. The CLIA method revealed a difference in the androstenedione levels between the groups with the number of oocytes obtained of less than 3 and more than 10. Moreover, the androstenedione levels measured by CLIA were significantly different between the patient groups (p0.05). Comparison of serum androstenedione levels measured by CLIA and HPLC-MS/MS, showed high correlations between the values [=0.73 (p0.001)], which makes it possible to use both methods equally, given the existing equipment of the clinical base. Conclusion. Prediction of ovarian response to stimulation is an important step in assisted reproductive technology programs. Measuring androstenedione concentration in blood serum on the day of transvaginal ovarian puncture with highly specific methods (CLIA and HPLC-MS/MS) can be used to predict the degree of ovarian response along with the traditional assessment of the ovarian reserve based on determining anti-Mullerian hormone levels in the early follicular phase of the menstrual cycle.


2019 ◽  
Vol 48 (1) ◽  
pp. 40-45
Author(s):  
Lin Liang ◽  
Xiao-Xi Zhao

AbstractObjectiveTo investigate the correlation between aneuploidy pregnancy and the concentration of various hormones and vascular endothelial factor in follicular fluid as well as the number of acquired oocytes and to provide a scientific basis for improving ovulation induction programs.MethodsIn total, we collected 277 follicular fluid specimens from patients undergoing in vitro fertilization (IVF) treatment in our hospital. Eighteen cases of aneuploidy embryos were identified. The follicular fluid of these aneuploidy embryos was used for the study. According to the case and control 1:5 paired design, we selected five age-matched controls with healthy births following IVF for each aneuploidy case. Concentrations of anti-Müllerian hormone (AMH), follicle-stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), estrogen (E2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the follicular fluid were measured. Conditional logistic regression was used to analyze the relationship between aneuploidy pregnancy and the concentrations of various hormones and VEGF in the follicular fluid as well as the number of acquired oocytes.ResultsMultivariate conditional logistic regression showed that of all the factors analyzed, only FSH [odds ratio (OR) = 1.300, 95% confidence interval (CI), 1.091–1.548, P = 0.003] level in the follicular fluid and the number of acquired oocytes (OR = 1.179, 95% CI, 1.070–1.299, P = 0.001) were closely related to aneuploidy pregnancy. No other factors were found to be associated with aneuploidy pregnancy.ConclusionFSH concentrations in the follicular fluid are risk factors for aneuploidy pregnancies. The higher the number of eggs, the higher the risk of aneuploidy. These findings may help improve ovulation induction programs.


2020 ◽  
Vol 2020 ◽  
pp. 1-12
Author(s):  
Zulipiya Maimaiti ◽  
Ablajan Turak ◽  
Qing Ling Ma ◽  
Geyu Liu ◽  
Haji Akbar Aisa

In traditional Chinese medicine, the seeds of Vernonia anthelmintica (L.) Willd. have been widely used for treatment of cough, skin diseases, diarrhea, fever, schistosomiasis, amoebic dysentery, and gastrointestinal problems, especially in the treatment of vitiligo for thousands of years in China. In this study, an effective, reliable, and accurate high-performance liquid chromatography diode array detector (HPLC-DAD) method was developed for quantitative analysis of 3 marker bioactive compounds and chemical fingerprint of the seeds of V. anthelmintica. Data corresponding to common peak areas and HPLC chromatographic fingerprints were analyzed by exploratory hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA) to extract information of the most significant variables contributing to characterization and classification of the analyzed samples. Based on variety and origin, the high-performance thin layer chromatography (HPTLC) method validated the chemical fingerprint results used to screen the in vitro antioxidant activity of V. anthelmintica. The results show that the developed method has potential application values for the quality consistency evaluation and identification of similar instant V. anthelmintica samples. When considered collectively, this research results provide a scientific basis for the improvement of standardization and specification of V. anthelmintica medicinal materials and provide a pathway for the development and utilization of references for the identification of V. anthelmintica herbs.


2021 ◽  
Author(s):  
Ιωάννα-Βαλεντίνη Δάγλα

Η κολιστίνη (πολυμυξίνη Ε) είναι ένα αντιβιοτικό που αποτελείται κυρίως από τις μορφές Α και Β και παράγεται από το βακτήριο Bacillus polymyxa var. colistinus. Απομονώθηκε για πρώτη από το βακτήριο το 1949 και αργότερα χορηγήθηκε ως μεθανοσουλφονική κολιστίνη (colistimethate sodium - CMS) για την αντιμετώπιση των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η χρήση της, όμως, περιορίστηκε τη δεκαετία του ’80 λόγω της νευροτοξικότητας και της νεφροτοξικότητας που προκαλούσε. Λόγω της εμφάνισης πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηριών τις τελευταίες δύο δεκαετίες, η κολιστίνη άρχισε να χρησιμοποιείται ξανά ως αντιβιοτικό τελευταίας εκλογής, όταν όλες οι θεραπείες με άλλα αντιβιοτικά έχουν αποτύχει, καθώς αντιμετωπίζει αποτελεσματικά τις λοιμώξεις που οφείλονται σε αυτά τα βακτήρια. Η κολιστίνη χορηγείται παρεντερικά ως CMS που αποτελεί το ανενεργό και λιγότερο τοξικό προφάρμακο της κολιστίνης, το οποίο υδρολύεται στον οργανισμό (in vivo) δίνοντας την ενεργή μορφή (κολιστίνη). Η CMS παράγεται κατόπιν σουλφομεθυλίωσης των ελεύθερων αμινομάδων που υπάρχουν στο μόριο της κολιστίνης. Ωστόσο, η δομή της παραμένει μέχρι σήμερα ασαφής, καθώς δεν έχει εξακριβωθεί ο βαθμός της σουλφομεθυλίωσης των αμινομάδων. Είναι όμως γενικά αποδεκτό πως η CMS αποτελεί ένα πολύπλοκο μίγμα πολλών μορίων με διαφορετικό βαθμό υποκατάστασης. Η κολιστίνη αν και έχει ανακαλυφθεί εδώ και αρκετά χρόνια, δεν έχει υποβληθεί στις διαδικασίες ανάπτυξης φαρμάκων και έγκρισης που εφαρμόζονται σήμερα. Μέχρι σήμερα, οι έλεγχοι ποιότητας που εφαρμόζονται στα σκευάσματα της CMS βασίζονται σε μικροβιολογικές δοκιμασίες.Έχει παρατηρηθεί όμως πως, αν και τα φαρμακευτικά σκευάσματα της CMS ελέγχονται με μικροβιολογικές δοκιμασίες (in vitro), οδηγούν σε διαφορετικά επίπεδα ενεργής κολιστίνης στον οργανισμό (in vivo), τονίζοντας την ανάγκη για ανάπτυξη άλλων μεθόδων ποιοτικού ελέγχου των σκευασμάτων της CMS, ώστε να ελέγχεται με μεγαλύτερη ακρίβεια η σύσταση των φαρμακευτικών σκευασμάτων και κατ’ επέκταση η βιοδιαθεσιμότητά τους. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου που είναι βασισμένη στην υγρoχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης (ultra-high performance liquid chromatography – UPLC) συζευγμένη με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (high resolution mass spectrometry – HRMS), για την μέτρηση της CMS σε σκευάσματα. Η μέθοδος αυτή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος ποιοτικού ελέγχου των φαρμακευτικών σκευασμάτων της CMS. Αρχικά, λόγω της πολυπλοκότητας της CMS, κρίθηκε αναγκαίος ο πειραματικός σχεδιασμός για την βελτιστοποίηση των παραμέτρων τόσο της υγροχρωματογραφίας όσο και της φασματομετρίας μάζας. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλαμβάνει δύο στάδια στοχεύοντας τον διαχωρισμό των συστατικών της CMS. Τελικά, το χρωματογράφημα που προέκυψε αποκάλυψε 20 συστατικά. Ο διαχωρισμός επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τη στήλη Waters Acquity BEH C8 και βαθμιδωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από A) υδατικό διάλυμα φορμικού αμμωνίου (0,005 Μ, pH=6) και Β) μίγμα μεθανόλης και ακετονιτριλίου (79/21 v/v). Πειραματικός σχεδιασμός πραγματοποιήθηκε και για τις παραμέτρους της φασματομετρίας μάζας, ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη ευαισθησία. Για την ανάλυση, επιλέχθηκαν τα μονοφορτισμένα ιόντα των μορίων της CMS που προέκυψαν κατόπιν θετικού ιονισμού. Οι καμπύλες αναφοράς είχαν εύρος 50-110 μg/mL, που αντιστοιχεί στο 80-120% της ονομαστικής ποσότητας της CMS στα εμπορικά σκευάσματα. Λόγω της πολυπλοκότητας των χρωματογραφημάτων της CMS, αλλά και του φάσματος κάθε χρωματογραφικής κορυφής, εφαρμόστηκαν τεχνικές στοχευμένης (targeted) και μη στοχευμένης (untargeted) ανάλυσης χρησιμοποιώντας το λογισμικό MZmine. Εκτός από την κλασική μονοπαραμετρική στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε ακόμα το μοντέλο της παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (partial least squares regression – PLSR), καθώς οι μεταβλητές ήταν περισσότερες από τις παρατηρήσεις. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση παρτίδων της CMS και βρέθηκαν διαφορές στη σύστασή τους. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μεθοδολογία βασισμένη στην υγρoχρωματογραφία συζευγμένη με ανιχνευτή υπεριώδους (ultraviolet – UV) για την μέτρηση της CMS σε ενέσιμα σκευάσματα. Στην μεθοδολογία αυτή χρησιμοποιήθηκαν λογισμικά τα οποία είναι διαθέσιμα δωρεάν προκειμένου με ευκολία θα υιοθετηθεί από τις φαρμακευτικές εταιρείες αλλά και από την ερευνητική κοινότητα γενικότερα, ως μέθοδος ποιοτικού ελέγχου. Για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της χρωματογραφίας χρησιμοποιήθηκε πειραματικός σχεδιασμός. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των συστατικών της CMS επιτεύχθηκε με τη στήλη Waters Acquity BEH C8 και βαθμιδωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από Α) υδατικό διάλυμα φορμικού αμμωνίου (0,001 Μ) και Β) μίγμα μεθανόλης/ακετονιτριλίου (79/21 v/v). Τα μόρια της CMS ανιχνεύθηκαν στο μήκος κύματος 214 nm. Κατασκευάστηκαν 23 μονοπαραμετρικά μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης για την μέτρηση του κάθε συστατικού της CMS χωριστά και ένα μοντέλο PLSR για την εκτίμηση της συνολικής ποσότητας της CMS στα ενέσιμα σκευάσματα. Η μέθοδος επικυρώθηκε για το εύρος συγκεντρώσεων 110-220 μg/mL. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση παρτίδων της CMS. Οι παρτίδες συγκρίθηκαν ως προς μια παρτίδα αναφοράς με επιπλέον στατιστικές αναλύσεις, όπως ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis – PCA), μέτρα ομοιότητας, χάρτες θερμότητας (heatmaps) και τον δείκτη δομικής ομοιότητας (structural similarity index).Η μέτρηση των επιπέδων της CMS στα βιολογικά υλικά των ασθενών είναι πολύ σημαντική προκειμένου να βρεθεί το κατάλληλο δοσολογικό σχήμα που θα περιορίζει την τοξικότητά της. Μέχρι σήμερα, η μέτρηση της CMS γίνεται με έμμεσο τρόπο, δηλαδή μετά από την όξινη υδρόλυσή της σε κολιστίνη. Στην παρούσα διατριβή, σκοπός είναι να βρεθούν οι συνθήκες που οδηγούν σε πλήρη υδρόλυση της CMS. Η αντίδραση μελετήθηκε σε επιταχυνόμενες συνθήκες: 40°C, 50°C και 60°C και τα αποτελέσματα εκτιμήθηκαν με τη χρήση της εξίσωσης του Arrhenius και το λογισμικό Tenua. Για τη μέτρηση της CMS και της κολιστίνης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος βασισμένη στην υγροχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης συζευγμένης με φασματόμετρο μάζας με υβριδικό αναλυτή τετραπόλου – χρόνου πτήσης ιόντων (hybrid quadrupole time-of-flight – QqTOF). Με την παρούσα μεθοδολογία επιτεύχθηκε πλήρης υδρόλυση της CMS, σε αντίθεση με τις μεθοδολογίες που αναφέρονται στην βιβλιογραφία που, όπως αποδείχθηκε, οδηγούσαν σε μερική υδρόλυση. Αν και η χορήγηση της CMS αυξάνεται ραγδαία, η δομή της παραμένει ασαφής. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, έγιναν προσπάθειες αποσαφήνισης της δομής της CMS με τη χρήση της φασμοτομετρίας μάζας. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις αναλυτές μάζας: 1) QqTOF, 2) LTQ Orbitrap Discovery XL, 3) Q-Exactive Orbitrap and 4) Omnitrap. Η έγχυση (infusion) της CMS στον αναλυτή μάζας πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας διαφορετικές συνθήκες ως προς τον διαλύτη αραίωσης, το pH και τη θερμοκρασία αποδιαλύτωσης. Στους αναλυτές μάζας QqTOF και Omnitrap πραγματοποιήθηκαν επίσης πειράματα θραυσματοποίησης (MS/MS) και για την ερμηνεία τους χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Cyclobranch. Τελικά, βρέθηκαν οι δομές τριών συστατικών της CMS.


GYNECOLOGY ◽  
2020 ◽  
Vol 21 (6) ◽  
pp. 36-40
Author(s):  
Anna G. Burduli ◽  
Natalia A. Kitsilovskaya ◽  
Yuliya V. Sukhova ◽  
Irina A. Vedikhina ◽  
Tatiana Y. Ivanets ◽  
...  

The review presents data on metabolites in the follicular fluid (FF) from the perspective of reproductive medicine and their use in order to predict outcomes of assisted reproductive technology (ART) programs. It considers various components of this biological medium (hormones, lipids, melatonin, etc.) with an assessment of their predictive value in prognosis of the effectiveness of in vitro fertilization (IVF) programs. The data on experimental directions in this field and the prospects for their use in clinical practice are presented. The article emphasizes that the growing clinical need and the unsolved problem of increasing the effectiveness of ART programs determine the need for further studies of the FF composition. Materials and methods. The review includes data related to this topic from foreign and Russian articles found in PubMed which were published in recent years. Results. Given the established fact of a direct effect of FF composition on growth and maturation of oocytes, and further, on the fertilization process, various FF metabolites are actively investigated as non-invasive markers of quality of oocytes/embryos. The article provides data on the experimental directions in this field and the prospects for their use in clinical practice. However, clinical studies of a relation between various FF metabolites levels and outcomes of IVF programs are contradictory. Conclusion. Owing large economic cost for treatment of infertility with IVF, there is need for expansion and intensification of studies to identify and use reliable predictors in prognosis of ART programs outcomes.


Antioxidants ◽  
2021 ◽  
Vol 10 (8) ◽  
pp. 1206
Author(s):  
Aimilia D. Sklirou ◽  
Maria T. Angelopoulou ◽  
Aikaterini Argyropoulou ◽  
Eliza Chaita ◽  
Vasiliki Ioanna Boka ◽  
...  

Skin health is heavily affected by ultraviolet irradiation from the sun. In addition, senile skin is characterized by major changes in the collagen, elastin and in the hyaluronan content. Natural products (NPs) have been shown to delay cellular senescence or in vivo aging by regulating age-related signaling pathways. Moreover, NPs are a preferable source of photoprotective agents and have been proven to be useful against the undesirable skin hyperpigmentation. Greek flora harvests great plant diversity with approximately 6000 plant species, as it has a wealth of NPs. Here, we report an extensive screening among hundreds of plant species. More than 440 plant species and subspecies were selected and evaluated. The extracts were screened for their antioxidant and anti-melanogenic properties, while the most promising were further subjected to various in vitro and cell-based assays related to skin aging. In parallel, their chemical profile was analyzed with High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC) and/or Ultra-Performance Liquid Chromatography High-Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS). A variety of extracts were identified that can be of great value for the cosmetic industry, since they combine antioxidant, photoprotective, anti-melanogenic and anti-aging properties. In particular, the methanolic extracts of Sideritis scardica and Rosa damascena could be worthy of further attention, since they showed interesting chemical profiles and promising properties against specific targets involved in skin aging.


Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document