Sugar shock: Probing Streptococcus pyogenes metabolism through bioluminescence imaging

Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) can thrive in its host during an infection, and, as a result, it must be able to respond to external stimuli and available carbon sources. The pre-clinical use of engineered pathogens capable of constitutive light production may provide real-time information on microbial-specific metabolic processes. Here we mapped the central metabolism of a luxABCDE-modified S. pyogenes Xen20 (Strep. Xen20) to its de novo synthesis of luciferase substrates as assessed by the rate of light production in response to different environmental triggers. Previous characterization predicted that the lux operon was under the myo-inositol iolE promotor. Here we show that supplementation with myo-inositol generated increased Xen20 luminescence. Surprisingly, when supplemented with infection-relevant carbon sources, such as glucose or glycine, light production was diminished. This was presumably due to the scavenging of pyruvate by L-lactate dehydrogenase (LDH). Inhibition of LDH by its inhibitor, oxamate, partially restored luminescent signal in the presence of glucose, presumably by allowing the resulting pyruvate to proceed to acetyl-coenzyme A (CoA). This phenomenon appeared specific to the lactic acid bacterial metabolism as glucose or glycine did not reduce signal in an analogous luxABCDE-modified Gram-positive pathogen, Staph. Xen29. The Strep. Xen20 cells produced light in a concentration-dependent manner, inversely related to the amount of glucose present. Taken together, our measures of microbial response could provide new information regarding the responsiveness of S. pyogenes metabolism to acute changes in its local environments and cellular health.

RNA-Guided AsCas12a- and SpCas9-Catalyzed Knockout and Homology Directed Repair of the Omega-1 Locus of the Human Blood Fluke, Schistosoma mansoni

The efficiency of the RNA-guided AsCas12a nuclease of Acidaminococcus sp. was compared with SpCas9 from Streptococcus pyogenes, for functional genomics in Schistosoma mansoni. We deployed optimized conditions for the ratio of guide RNAs to the nuclease, donor templates, and electroporation parameters, to target a key schistosome enzyme termed omega-1. Programmed cleavages catalyzed by Cas12a and Cas9 resulted in staggered- and blunt-ended strand breaks, respectively. AsCas12a was more efficient than SpCas9 for gene knockout, as determined by TIDE analysis. CRISPResso2 analysis confirmed that most mutations were deletions. Knockout efficiency of both nucleases markedly increased in the presence of single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) template. With AsCas12a, ssODNs representative of both the non-CRISPR target (NT) and target (T) strands were tested, resulting in KO efficiencies of 15.67, 28.71, and 21.43% in the SpCas9 plus ssODN, AsCas12a plus NT-ssODN, and AsCas12a plus T-ssODN groups, respectively. Trans-cleavage against the ssODNs by activated AsCas12a was not apparent in vitro. SpCas9 catalyzed more precise transgene insertion, with knock-in efficiencies of 17.07% for the KI_Cas9 group, 14.58% for KI_Cas12a-NT-ssODN, and 12.37% for KI_Cas12a-T-ssODN. Although AsCas12a induced fewer mutations per genome than SpCas9, the phenotypic impact on transcription and expression of omega-1 was similar for both nucleases.

РЕЗУЛЬТАТИ ВИВЧЕННЯ МІКРОБНОГО СПЕКТРУ У ДІТЕЙ З РОЗЛАДАМИ СПЕКТРУ АУТИЗМУ, АСОЦІЙОВАНИМИ З ГЕНЕТИЧНИМ ДЕФІЦИТОМ ФОЛАТНОГО ЦИКЛУ

Обґрунтування. Результати п’яти мета-аналізів рандомізованих контрольованих клінічних досліджень свідчать про асоціацію генетичного дефіциту фолатного циклу (ГДФЦ) і розладів спектру аутизму (РАС) у дітей. В таких випадках формується імунодефіцит та імунна дисрегуляція, що знижує резистентність до деяких мікроорганізмів.Мета дослідження: вивчити структуру мікробного спектру у дітей з РАС, пов’язаними з ГДФЦ, згідно з накопиченою дотепер доказовою базою і вивчити асоціацію виявлених мікроорганізмів з показниками імунного статусу для покращення розуміння патогенезу енцефалопатії та удосконалення алгоритмів діагностики, моніторингу і лікування.Матеріали і методи. Ретроспективно проаналізовано медичні дані 225 дітей віком від 2 до 9 років з ГДФЦ, у яких відзначалися клінічні прояви за типом РАС (досліджувана група; ДГ; 183 хлопчиків і 42 дівчинки). До контрольної групи (КГ) віднесли 51 клінічно здорову дитину (37 хлопчиків та 14 дівчаток) аналогічного вікового розподілу, які не страждали на ГДФЦ. Спеціальне лабораторне обстеження дітей груп спостереження проводили з урахуванням сучасних уявлень щодо мікробного спектру у пацієнтів з РАС згідно з публікаціями в PubMed і Embase. Для вивчення асоціацій між досліджуваними показниками застосовували показник відношення шансів (odds ratio, OR) та 95% довірчий інтервал (95% СІ). Дослідження виконувалося як фрагмент науково-дослідної роботи на замовлення МОЗ України (№ держреєстрації 0121U107940).Результати та їх обговорення. TTV відзначався в 87%, HHV-7 – 79%, HHV-6 – 68%, EBV – 59%, Streptococcus pyogenes – 46%, Candida albicans – 41%, Borrelia – 34%, Mycoplasma pneumoniae – 27%, Chlamydia pneumoniae – 26%, Yersinia enterocolitica – 23%, Toxoplasma gondii – 19%, перенесена природжена CMV нейроінфекція – 7%, наслідки HSV-1/2-нейро-інфекції – 5% випадків в ДГ (р<0,05; Z<Z0,05). HHV-6, HHV-7 та EBV були асоційовані з дефіцитами NK-, NKT- та СD8+ цитотоксичних Т-лімфоцитів. ТТV також був асоційований з дефіцитами NK- та NKT-лімфоцитів, однак не з дефіцитом СD8+ цитотоксичних Т-клітин. Стрептококова інфекція була пов’язана з гіпо- і дисімуноглобулінемією, а також – дефіцитом мієлопероксидази. Кандидоз був асоційований тільки з дефіцитом мієлопероксидази. Токсоплазмоз відзначався при дефіциті СD4+ Т-хелперів та комбінованих порушеннях імунітету. Наслідки природженої CMV-нейроінфекції мали місце тільки при комбінованих порушеннях імунітету. Висновки. Для дітей з РАС, асоційованими з ГДФЦ, характерним є специфічний мікробний спектр з переважанням інтрацелюлярних опортуністичних та умовно патогенних мікроорганізмів, який визначається особливостями порушень в імунному статусі, спровокованих ГДФЦ, що має визначати алгоритм раціонального мікробіологічногопошуку, оцінки імунного статусу, проведення антимікробного та імунотропного лікування.

Examining the Executioners, Influenza Associated Secondary Bacterial Pneumonia

Influenza infections typically present mild to moderate morbidities in immunocompetent host and are often resolved within 14 days of infection onset. Death from influenza infection alone is uncommon; however, antecedent influenza infection often leads to an increased susceptibility to secondary bacterial pneumonia. Bacterial pneumonia following viral infection exhibits mortality rates greater than 10-fold of those of influenza alone. Furthermore, bacterial pneumonia has been identified as the major contributor to mortality during each of the previous four influenza pandemics. Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pyogenes are the most prevalent participants in this pathology. Of note, these lung pathogens are frequently found as commensals of the upper respiratory tract. Herein we describe influenza-induced host-changes that lead to increased susceptibility to bacterial pneumonia, review virulence strategies employed by the most prevalent secondary bacterial pneumonia species, and highlight recent findings of bacterial sensing and responding to the influenza infected environment.

Evolution of Gram+ Streptococcus pyogenes has maximized efficiency of the Sortase A cleavage site

Human plasminogen (hPg)-binding M-protein (PAM), a major virulence factor of Pattern D Streptococcus pyogenes (GAS), is the primary receptor responsible for binding and activating hPg. PAM is covalently bound to the cell wall (CW) through cell membrane (CM)-resident sortase A (SrtA)-catalyzed cleavage of the PAM-proximal C-terminal LPST¯-GEAA motif present immediately upstream of its transmembrane domain (TMD), and subsequent transpeptidation to the CW. These steps expose the N-terminus of PAM to the extracellular milieu (EM) to interact with PAM ligands, e.g., hPg. Previously, we found that inactivation of SrtA showed little reduction in functional binding of PAM to hPg, indicating that PAM retained in the cell membrane (CM) by the TMD nonetheless exposed its N-terminus to the EM. In the current study, we assessed the effects of mutating the Thr4 (P1) residue of the SrtA-cleavage site in PAM (Thr355 in PAM) to delay PAM in the CM in the presence of SrtA. Using rSrtA in vitro, LPSYGEAA and LPSWGEAA peptides were shown to have low activities, while LPSTGEAA had the highest activity. Isolated CM fractions of AP53/DSrtA cells showed that LPSYGEAA and LPSWGEAA peptides were cleaved at substantially faster rates than LPSTGEAA, even in CMs with an AP53/DSrtA/PAM[T355Y] double mutation, but the transpeptidation step did not occur. These results implicate another CM-resident enzyme that cleaves LPSYGEAA and LPSWGEAA motifs, most likely LPXTGase, but cannot catalyze the transpeptidation step. We conclude that the natural P1 (Thr) of the SrtA cleavage site has evolved to dampen PAM from nonfunctional cleavage by LPXTGase.