Evaluation of Plant Origin Essential Oils as Herbal Biocides for the Protection of Caves Belonging to Natural and Cultural Heritage Sites

The present study concerns the serious issue of biodeterioration of the caves belonging to natural and cultural heritage sites due to the development of various microorganisms. Thus, a series of 18 essential oils (EOs) extracted from various Greek plants were evaluated in vitro (concentrations of 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 and 5.0% v/v) against 35 bacterial and 31 fungi isolates (isolated from a Greek cave) and the antimicrobial activity was evident through the changes in optical density of microbial suspensions. In continuance, eight (8) representative bacterial and fungal isolates were further used to evaluate the minimum inhibitory concentration (MIC) and non-inhibitory concentration (NIC) values of the most effective EOs. According to the results, two EOs of Origanum vulgare were the most effective by inhibiting the growth of all the tested microorganisms at 0.1% (v/v), followed by that of Satureja thymbra which inhibited all bacterial isolates at 0.1% (v/v) and fungal isolates at 0.1, 0.2 and 0.5% (v/v) (depending on the isolate). The MIC ranged between 0.015–0.157 and 0.013–0.156 (v/v) for the bacterial and fungal isolates respectively, depending on the case. The current study demonstrated that conventional biocides may be replaced by herbal biocides with significant prospects for commercial exploitation.

Nanovesicles Loaded with Origanum onites and Satureja thymbra Essential Oils and Their Activity against Food-Borne Pathogens and Spoilage Microorganisms

Food poisoning is a common cause of illness and death in developing countries. Essential oils (EOs) could be effective and safe natural preservatives to prevent and control bacterial contamination of foods. However, their high sensitivity and strong flavor limit their application and biological effectiveness. The aim of this study was firstly the chemical analysis and the antimicrobial evaluation of the EOs of Origanum onites L. and Satureja thymbra L. obtained from Symi island (Greece), and, secondly, the formulation of propylene glycol-nanovesicles loaded with these EOs to improve their antimicrobial properties. The EOs were analyzed by GC-MS and their chemical contents are presented herein. Different nanovesicles were formulated with small average sizes, high homogeneity, and optimal ζ-potential. Microscopic observation confirmed their small and spherical shape. Antibacterial and antifungal activities of the formulated EOs were evaluated against food-borne pathogens and spoilage microorganisms compared to pure EOs. Propylene glycol-nanovesicles loaded with O. onites EO were found to be the most active formulation against all tested strains. Additionally, in vitro studies on the HaCaT cell line showed that nanovesicles encapsulated with EOs had no toxic effect. The present study revealed that both EOs can be used as alternative sanitizers and preservatives in the food industry, and that their formulation in nanovesicles can provide a suitable approach as food-grade delivery system.

Μελέτη αντιμικροβιακής δράσης φυσικών προϊόντων

Τελευταία, γίνεται προσπάθεια για τη δραστική μείωση ή και εξάλειψη των χημικών συντηρητικών από τα τρόφιμα και την αντικατάστασή τους από φυσικά συντηρητικά, όπως τα αιθέρια έλαια. Τα αιθέρια έλαια είναι σύνθετα μίγματα πτητικών δευτερογενών μεταβολιτών από φυτά, με σημαντική αντιμικροβιακή δράση. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων που απομονώθηκαν από φυτά της οικογένειας Lamiaceae και συγκεκριμένα των Origanum onites, Origanum dittamnus, Origanum vulgare ssp. hirtum (δύο χημειότυποι), Thymus capitatus, Satureja thymbra, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Siseritis raeseri subsp. raeseri, της οικογένειας Anacardiaceae, (Pistacia lentiscus), της οικογένειας Apiaceceae (Pimpinella anisum), της οικογένειας Rutaceae (Citrus medica και Fortunella margarita) και της οικογένειας Verbenaceae (Lippia citriodora). Επίσης, μελετήθηκαν ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση και ορισμένες από τις κύριες ενώσεις των αιθέριων ελαίων.Επιπλέον, τα στερεά υποπροϊόντα της υδροατμοαπόσταξης των Origanum onites, Origanum vulgare, Thymus capitatus και Satureja thymbra υποβλήθηκαν σε διαδοχική εκχύλιση Soxhlet με οξικό αιθυλεστέρα και αιθανόλη και τα εκχυλίσματα που ελήφθησαν μελετήθηκαν στη συνέχεια για πιθανή αντιμικροβιακή δράση. Επίσης, εξετάστηκαν τα υδατικά υπολείμματα υδροατμοαπόσταξης των Satureja thymbra, Pistacia lentiscus, Pimpinella anisum, Citrus medica, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Lippia citriodora και Fortunella margarita. Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων, των εκχυλισμάτων και των υδατικών υπολειμμάτων μελετήθηκε αρχικά με τη δοκιμασία διάχυσης με χρήση δισκίων έναντι των κοινών αλλοιογόνων και τροφιμογενών παθογόνων μικροβιακών ειδών Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Pseudomonas fragi, Clostridium difficile, Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκαν οι τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum inhibitory concentration, MIC) και μη ανασταλτικής συγκέντρωσης (Νon-inhibitory concentration, NIC), συνδυάζοντας τις μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας με τη κοινή μέθοδο των αραιώσεων και τη μη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης (non-linear regression analysis), χρησιμοποιώντας το μοντέλο LPM.Το μοντέλο LPM δεν ήταν δυνατό να εφαρμοστεί στην περίπτωση των Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger λόγω της καθίζησης των κυττάρων ζυμομύκητα και της επίπλευσης των κονιδίων του Aspergillus niger. Γι' αυτό, χρησιμοποιήθηκαν τα πρωτόκολλα που περιγράφονται από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή (EUCAST) για τον προσδιορισμό των τιμών MIC των Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger. Επίσης, προσδιορίστηκαν οι τιμές ελάχιστης βακτηριοκτόνου συγκέντρωσης (MBC) ή ελάχιστης θανατηφόρου συγκέντρωσης (MLC). Όλα τα αιθέρια έλαια εμφάνισαν αξιοσημείωτη αντιμικροβιακή δράση έναντι όλων των μικροβιακών ειδών που μελετήθηκαν, εκτός από το αιθέριο έλαιο Pistacia lentiscus, το οποίο δεν είχε δράση έναντι των Salmonella Enteritidis και Salmonella Typhimurium, το αιθέριο έλαιο Lippia citriodora που ήταν ενεργό μόνο έναντι gram (+) βακτηρίων και τα αιθέρια έλαια Fortunella margarita και Pimpinella anisum που είχαν αντιμικροβιακή δράση μόνο κατά των Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger. Τα εκχυλίσματα που προέκυψαν από τα στερεά υποπροϊόντα των Origanum onites, Origanum vulgare, Thymus capitatus και Satureja thymbra εμφάνισαν μόνο αντιβακτηριακή δράση. Απεναντίας, τα υδατικά εκχυλίσματα Satureja thymbra, Pistacia lentiscus, Pimpinella anisum, Citrus medica, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Lippia citriodora και Fortunella margarita δεν είχαν αντιμικροβιακή δράση. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα αιθέρια έλαια ήταν πιο δραστικά από τα βασικά συστατικά τους, καθώς προσδιορίστηκαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές MIC, NIC και MBC ή MLC. Τα εκχυλίσματα οξικού αιθυλεστέρα (EAc) και αιθανόλης (EtOH) και το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοαπόσταξης (Aq) του φυτού Satureja thymbra και το αιθέριο έλαιο Origanum vulgare spp. hirtum επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη ως πιθανά βιοσυντηρητικά σε τρόφιμα, καθώς έδειξαν σημαντικές αντιμικροβιακές ιδιότητες. Τα εκχυλίσματα Satureja thymbra ενσωματώθηκαν σε γαλακτώματα που προσομοιάζουν σάλτσες για σαλάτες (salad dressings), ενώ το αιθέριο έλαιο Origanum vulgare spp. hirtum σε γαλακτωμάτων που μπορούν να ενσωματωθούν σε τελικά προϊόντα, όπως ο χυμός τομάτας και μελετήθηκε η φυσική αλλοίωση των προϊόντων, καθώς και η ανασταλτική δράση κυτταρικής ανάπτυξης μετά από εσκεμμένη επιμόλυνση των γαλακτωμάτων με 2 log cfu/mL Listeria monocytogenes και του τοματοχυμού με 4 log cfu/mL Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Saccharomyces cerevisiae ή 10000 σπόρια/mL Aspergillus niger. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο τα εκχυλίσματα, εκτός από το υδατικό όσο και το αιθέριο έλαιο Origanum vulgare spp. hirtum παρέτειναν το χρόνο ζωής των προϊόντων και κατέστειλαν την μικροβιακή ανάπτυξη μετά από σκόπιμη επιμόλυνση. Η ενσωμάτωση αιθέριου ελαίου Origanum vulgare spp. hirtum στον τοματοχυμό σε συγκέντρωση χαμηλότερη από την τιμή MIC ή μόνο ελαφρώς υψηλότερη από την τιμή NIC που προσδιορίστηκε για το C. difficile ήταν αρκετή για να καταστείλει την ανάπτυξη των σκόπιμα εμβολιασμένων μικροβίων, γεγονός που υποδηλώνει συνεργιστική δράση ανάμεσα στο αιθέριο έλαιο και τη χαμηλή θερμοκρασία συντήρησης. Οι μικροοργανισμοί πολύ συχνά αδυνατούν να ξεπεράσουν το συνδυασμό πολλών συστημάτων συντήρησης και ως εκ τούτου τα πολλαπλά εμπόδια μπορούν να οδηγήσουν σε ένα σταθερό και ασφαλές προϊόν χωρίς αλλοίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών. Επιπλέον, το μίγμα (Mix) των αιθέριων ελαίων Pistacia lentiscus και Fortunella margarita, καθώς και το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοπόσταξης του Fortunella margarita δοκιμάστηκε ως πιθανό βιοσυντηρητικό σε προϊόντα παγωτών και χυμών φρούτων. Στα παγωτά το αιθέριο έλαιο Pistacia lentiscus λειτούργησε ως πιθανό βιοσυντηρητικό ενώ το αιθέριο έλαιο Fortunella margarita, καθώς και το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοπόσταξης του Fortunella margarita χρησιμοποιήθηκαν ως βελτιωτικά γεύσης. Στους χυμούς, σαν βιοσυντηρητικά χρησιμοποιήθηκαν το αιθέριο έλαιο Pistacia lentiscus και το αιθέριο έλαιο Fortunella margarita ενώ το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοπόσταξης του Fortunella margarita ως βελτιωτικό γεύσης. Αρχικά, εξετάστηκε η φυσική αλλοίωση των προϊόντων και στη συνέχεια μελετήθηκε η αναστολή κυτταρικής ανάπτυξης μετά από σκόπιμη επιμόλυνση των παγωτών με 4 log cfu/mL Escherichia coli, Listeria monocytogenes, ή Pseudomonas fragi και των χυμών με 4 log cfu/mL Saccharomyces cerevisiae ή 100 σπόρια Aspergillus niger/mL. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική καθυστέρηση της αλλοίωσης των τροφίμων και επέκταση της διάρκειας ζωής των προϊόντων, καθώς και αναστολή κυτταρικής ανάπτυξης σε όλες τις περιπτώσεις. Η χρήση αιθέριων ελαίων μπορεί επομένως να θεωρηθεί ένας πρόσθετος εγγενής ανασταλτικός παράγοντας (εμπόδιο) ανάπτυξης για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων, ξεπερώντας τους περιορισμούς που σχετίζονται με την έντονη οσμή τους σε αποτελεσματικές δόσεις όταν προστίθενται σε περίπλοκα συστήματα τροφίμων. Τα αιθέρια έλαια των αρωματικών φυτών που μελετήθηκαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν βιοσυντηρητικά ή να αποτελέσουν σημαντικές πηγές αντιμικροβιακών παραγόντων χαμηλού κόστους που μπορούν να αξιοποιηθούν από την βιομηχανία τροφίμων.

In vitro haemostatic efficacy of aqueous, methanol and ethanol plant extracts of three medicinal plant species in Palestine

The haemostatic efficacy of different extract types of Satureja thymbra L., Thymbra spicata L. (Lamiaceae) and Verbascum fruticulosum Post. (Scrophulariaceae) was evaluated in this study via the Prothrombin time (PT) and Activated partial thromboplastin time (aPTT) analysis. Aqueous, methanol and ethanol extracts of the examined plant species leaves were prepared to a final concentration 50 mg/mL. In vitro PT and aPTT assays were conducted on normal platelet poor plasma blood samples by a digital coagulation analyzer. The obtained results revealed anticoagulation activity of all investigated plant species with observed variations among them. The aqueous and ethanol extracts of T. spicata as well as the aqueous extract of S. thymbra prolonged PT values significantly (p < 0.05). While, all V. fruticulosum extract types have had no significant effect on the PT values. The recorded aPTT data showed that all aqueous extracts have had a significant effect on the blood haemostasis as they increased aPTT values in all plant species under study. Out of which, both the ethanol and methanol extracts of T. spicata and methanol extract of S. thymbra showed similar effect. Of great concern, it was clearly noticed that the aqueous and ethanol extract of T. spicata and the aqueous extract of S. thymbra possess the strongest anticoagulation effect as they increased both PT and aPTT values significantly relative to the control (p < 0.05). The variable anticoagulation bioactivity among the studied plant species could be referred to the various solvents degrees of solubility of different phyto-constituents. Thus, the efficacy of the plant species extracts evaluation as anticoagulants or coagulants were related to the plant species and to the solvent of extraction.

Μελέτη και αξιοποίηση της ελληνικής φυσικής και αγροτικής βιοποικιλότητας για την ανάπτυξη νέων βιοκτόνων

Τα κουνούπια αποτελούν μία από τις πλέον οχλούσες ομάδες αιμομυζητικών εντόμων που συχνά λειτουργούν ως διαβιβαστές σοβαρών λοιμωδών νοσημάτων με σημαντικό κοινωνικό και οικονομικό αντίκτυπο. Tο εντεινόμενο φαινόμενο των «χωροκατακτητικών ειδών», σε συνδυασμό με τους αλληλένδετους περιβαλλοντικούς, νομοθετικούς και οικονομικούς περιορισμούς που εμφανίζει η σύγχρονη αντιμετώπιση των κουνουπιών, καθιστούν επιτακτική την ανάγκη ανεύρεσης νέων, αποτελεσματικών και φιλικών προς το περιβάλλον μεθόδων διαχείρισής τους. Υπό το πρίσμα αυτό, τα αιθέρια έλαια (ΑΕ), εξαιτίας των σημαντικών προνυμφοκτόνων και εντομο-απωθητικών ιδιοτήτων τους, αλλά και του ασφαλούς περιβαλλοντικού τους προφίλ αποτελούν μία υποσχόμενη πηγή εναλλακτικών φυσικών βιοκτόνων. Η παρούσα διατριβή, εντάσσεται στο πλαίσιο αυτό, έχοντας ως αντικείμενο την μελέτη και αξιοποίηση αιθερίων ελαίων της ελληνικής φυσικής και αγροτικής βιοποικιλότητας για την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών φυσικών παραγόντων ελέγχου των κουνουπιών. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκαν – αξιολογήθηκαν συνολικά 67 ΑΕ που παραλήφθηκαν από τρεις ευδιάκριτες ομάδες φυτών της ελληνικής βιοποικιλότητας: Α) αυτοφυής βιοποικιλότητα - το γένος Juniperus (33 ΑΕ), Β) αγροτική βιοποικιλότητα - το γένος Citrus (18 ΑΕ), Γ) ελληνικά αρωματικά - αρτυματικά φυτά (16 ΑΕ). Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η απόδοση των αιθερίων ελαίων που προέκυψαν από την υδρο-απόσταξη των υπό μελέτη φυτικών μερών και προσδιορίστηκε η χημική τους σύσταση με αέρια χρωματογραφία - φασματομετρία μαζών (GC-MS). Στο μέρος αυτό αξιολογήθηκε και μια σειρά κρίσιμων παραγόντων (εποχιακή διακύμανση, μηχανική επεξεργασία, βιομηχανική επεξεργασία του φυτικού υλικού) που αφορούν τις προοπτικές και δυνατότητες αξιοποίησης των σχετικών αποτελεσμάτων. Τα ΑΕ που εμφάνισαν ικανοποιητικές αποδόσεις μελετήθηκαν στη συνέχεια ως προς την απωθητική και προνυμφοκτόνο δράση τους έναντι του χωροκατακτητικού είδους Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse, 1894) (Ασιατικό κουνούπι Τίγρης). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τέσσερα ΑΕ της ομάδας Α, προερχόμενα από συλλογές φύλλων των ειδών Juniperus phoenicea και J. drupacea, δύο ΑΕ της ομάδας Β, προερχόμενα από τους καρπούς των ειδών Citrus sinensis και C. japonica, και τρία ΑΕ της ομάδας Γ, προερχόμενα από τα είδη Thymbra capitata, Origanum onites και Satureja thymbra (οικογένεια Lamiaceae), αξιολογήθηκαν ως αποτελεσματικά βιοκτόνα, καθώς εμφάνισαν ταυτόχρονα ισχυρή προνυμφοκτόνο και απωθητική δράση έναντι του Ae. albopictus. Τα πλούσια σε καρβακρόλη αιθέρια έλαια (ΠΚΑΕ) των προαναφερθέντων τριών ειδών της ομάδας Γ αναδείχθηκαν, από πλευράς απόδοσης, σύστασης και βιοδραστικότητας, ως η πλέον πρόσφορη προς περαιτέρω ανάπτυξη ομάδα αιθερίων ελαίων για τον έλεγχο των κουνουπιών. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, παρουσιάζεται η εξελικτική πορεία ανάπτυξης, των ΠΚΑΕ, από το επίπεδο των εργαστηριακών βιοδοκιμών στις εφαρμογές πεδίου. Για την αύξηση κλίμακος των βιοδοκιμών επιλέχθηκε το ΠΚΑΕ της εμπορικής ποικιλίας Origanum vulgare ssp. hirtum για το οποίο διενεργήθηκαν μελέτες δόσης–απόκρισης και οικο-τοξικότητας, δείχνοντας ότι διαθέτει σημαντική προνυμφοκτόνο (LC90: 58,747 mg/L) και απωθητική δράση (0,2 μL/cm2) ενάντια στο Ae. albopictus, αλλά και υψηλή τοξικότητα (LC90: 12,806 mg/L) στο είδος Macrocyclops albidus. Γαλάκτωμα του ΠΚΑΕ ρίγανης αξιολογήθηκε ως απωθητικό χώρου στο πεδίο, εμφανίζοντας μέγιστη δράση την πρώτη ημέρα μετά την εφαρμογή (86%), η οποία σταδιακά εξασθένισε τις επόμενες δύο ημέρες (81% και 69%). Κατά τις δοκιμές της προνυμφοκτόνου δράσης σε λεκάνες απορροής ομβρίων υδάτων, μελετήθηκαν τόσο καθαρό ΠΚΑΕ ρίγανης, όσο και γαλάκτωμα αυτού, τα οποία αποδείχθηκαν ιδιαίτερα αποτελεσματικά εναντίον των ειδών Ae. albopictus και Culex pipiens, με το πρώτο (τρεις εβδομάδες) να παρουσιάζει σχετικά μεγαλύτερη διάρκεια σε σχέση με το δεύτερο (δυο εβδομάδες). Το τελικά προϊόν που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο διενέργειας της διατριβής είναι δυνατόν να αποτελέσει ένα πολλά υποσχόμενο εναλλακτικό φυσικό εντομοκτόνο.