Analysis of inflammatory gene induction by oxidized phospholipids in vivo by quantitative real-time RT-PCR in comparison with effects of LPS

2002 ◽  
Vol 38 (4) ◽  
pp. 219-227 ◽  
Author(s):  
Alexandra Kadl ◽  
Joakim Huber ◽  
Florian Gruber ◽  
Valery N. Bochkov ◽  
Bernd R. Binder ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Gene Induction ◽  
Oxidized Phospholipids ◽  
Rt Pcr ◽  
Inflammatory Gene

scholarly journals Quantitative assessment of CYP11B1 and CYP11B2 expression in aldosterone-producing adenomas

2002 ◽  
pp. 795-802 ◽  
Author(s):  
F Fallo ◽  
V Pezzi ◽  
L Barzon ◽  
P Mulatero ◽  
F Veglio ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Secretory Activity ◽  
Zona Glomerulosa ◽  
Zona Fasciculata ◽  
Mrna Levels ◽  
Rt Pcr ◽  
Pathophysiological Role ◽  
Aldosterone Production

BACKGROUND: The presence and pathophysiological role of CYP11B1 (11beta-hydroxylase) gene in the zona glomerulosa of human adrenal cortex is still controversial. METHODS: In order to specifically quantify CYP11B1, CYP11B2 (aldosterone synthase) and CYP17(17alpha-hydroxylase) mRNA levels, we developed a real-time RT-PCR assay and examined the expression in a series of adrenal tIssues, including six normal adrenals from patients adrenalectomized for renal cancer and twelve aldosterone-producing adenomas (APA) from patients with primary aldosteronism. RESULTS: CYP11B1 mRNA levels were clearly detected in normal adrenals, which comprised both zona glomerulosa and fasciculata/reticularis cells, but were also measured at a lower range (P<0.05) in APA. The levels of CYP11B2 mRNA were lower (P<0.005) in normal adrenals than in APA. CYP17 mRNAlevels were similar in normal adrenals and in APA. In patients with APA, CYP11B2 and CYP11B1 mRNA levels were not correlated either with basal aldosterone or with the change from basal aldosterone in response to posture or to dexamethasone. No correlation between CYP11B1 mRNA or CYP11B2 mRNA and the percentage of zona fasciculata-like cells was observed in APA. CONCLUSIONS: Real-time RT-PCR can be reliably used to quantify CYP11B1 and CYP11B2 mRNA levels in adrenal tIssues. Expression of CYP11B1 in hyperfunctioning zona glomerulosa suggests an additional formation of corticosterone via 11beta-hydroxylase, providing further substrate for aldosterone biosynthesis. CYP11B1 and CYP11B2 mRNA levels in APA are not related to the in vivo secretory activity of glomerulosa cells, where post-transcriptional factors might ultimately regulate aldosterone production.

scholarly journals Jianpi Yangwei decoction promotes apoptosis and suppresses proliferation of 5-fluorouracil resistant gastric cancer cells in vitro and in vivo

2020 ◽  
Vol 20 (1) ◽  
Author(s):  
Huijuan Tang ◽  
Wenjie Huang ◽  
Qiang Yang ◽  
Ying Lin ◽  
Yihui Chen ◽  
...  
Keyword(s):  
Gastric Cancer ◽  
Drug Resistance ◽  
Cell Line ◽  
Real Time ◽  
Mtt Assay ◽  
Xenograft Tumor ◽  
Rt Pcr ◽  
Induced Apoptosis

Abstract Background The exploration of new therapeutic agents targeting 5-Fu resistance may open a new opportunity to gastric cancer treatment. The objective is to establish a 5-Fu resistant gastric cancer cell line and observe the effect of Jianpi Yangwei decoction (JPYW) on its apoptosis and drug-resistance related proteins. Methods MTT assay was used to measure the effect of JPYW on the BGC823 cells proliferation, and the apoptosis was observed by flow cytometry and Hoechst fluorescence staining. The BGC823 xenograft tumor nude mice models were established, the apoptosis was detected by Tunel method. BGC-823/5-Fu was established by repeated low-dose 5-Fu shocks, the drug resistance index and proliferation were detected by the MTT assay; MDR1 mRNA was detected by real-time RT-PCR; Western blot was used to detect the ratio of p-AKT to AKT; The BGC823/5-Fu xenograft tumor nude mice models were established and apoptosis was measured. The expressions of MRP1, MDR1, ABCG2, AKT, p-AKT, caspase-3 and bcl-2 were detected by immunohistochemistry and the AKT mRNA expression was detected by real-time RT-PCR. Results JPYW induced apoptosis in BGC823 cells; Drug-resistant cell line BGC-823/5-Fu was sucessfully established; JPYW induced apoptosis of BGC823/5-Fu cells, down-regulated the expression of MRP1, MDR1 and ABCG2 in vitro and in vivo, and further decreased MDR1 expression when combined with pathway inhibitor LY294002 (P < 0.05); JPYW down-regulated the ratio of p-AKT to AKT in vitro in a dose-dependent manner, the same as after the combination with LY294002 (P < 0.05). Conclusion JPYW can induce apoptosis of BGC823 and BGC823/5-Fu cells, and down-regulate the expression of MDR1, MRP1, ABCG2 in vitro and in vivo. Its in vitro effect is related to the PI3K/AKT signaling pathway.

Intracellular Levels of Oblimersen Sodium and Target Downregulation Correlates to Clinical Activity of bcl-2 Antisense in Acute Myeoid Leukemia (AML).

Blood ◽  
2004 ◽  
Vol 104 (11) ◽  
pp. 1170-1170
Author(s):  
Guido Marcucci ◽  
W. Stock ◽  
G. Dai ◽  
S. Liu ◽  
R. Klisovic ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Cross Reactivity ◽  
Phase Iii ◽  
Clinical Activity ◽  
Rt Pcr ◽  
Limit Of Quantification ◽  
Whitney Test ◽  
Mann Whitney Test

Abstract Oblimersen sodium (Ob, Genasense™) is an 18 mer phosphorothioate antisense directed against bcl-2, an antiapoptotic protein that mediates chemoresistance in malignant cells. In order to assess whether detectable intracellular concentrations (ICs) of Ob are achievable in vivo, we have developed a sensitive and specific ELISA-based assay. This assay involves Ob hybridization to a 5′-end overhang of a 3′-biotinylated capture probe ligated to a digoxigenin (Dig)-labeled probe, and detection by an anti-Dig-alkaline phosphatase system. In K562 cell extract, the assay was linear within 50–2000 pM range with a limit of quantification (LOQ) of 50 pM (equivalent to 5.0 fmol/100 μL). The withtin-run coefficients of variation (CVs) in 4 spiked concentrations were between 3–7% in 6 replicates with accuracy values between 93–109%. The between-run CVs were between 6–12% and accuracy values between 97–102%. The specificity of the assay was demonstrated by low cross reactivity with mismatched oligonucleotides and putative 3′-end metabolites shortened by 1, 2 or 3 nucleotides. Validation of IC measurement was performed in vitro in K562 cells treated with fluorescent labeled Ob conjugated to oligofectamine. At Ob concentrations between 0.1 – 10 μM, Bcl-2 mRNA downregulation measured by real-time RT-PCR occurred efficiently. Nonlinear regression analysis of a dose-response curve showed that 50% Bcl-2 downregulation (IC50) occurred at approximately 0.29 μM, corresponding to an Ob IC concentration of 37 pmole/mg protein. Cellular uptake was confirmed by microscopy and flow cytometry. To validate these results in vivo, we measured Ob IC in bone marrow samples from untreated AML pts aged &gt; 60 yrs enrolled on the phase I study OSU 0164. These pts were induced with Ob 7 mg/kg/d CIVI on days 1–10, cytarabine 100 mg/m2/d CIVI on days 4–10 and daunorubicin administered iv at two dose levels (45 mg/m2/d IV and 60 mg/m2/d) on days 4–6. Among 21 pts assessable for clinical response and Bcl-2 levels, at pretreatment, Bcl-2 copy numbers (normalized to ABL) were higher among 12 pts who achieved a CR (median 85,325; range 19,120–149,100) than among 9 non-responsive (NR) pts (32,100 bcl-2 /abl copies; range 1,488–163,500) (P=.04; Mann-Whitney test). Following 72 hr Ob infusion, a decrease (−38%) in median Bcl-2/ABL mRNA copies in CR patients and an increase (+115%) in Bcl-2/ABL copies in NR pts (P=.002; Mann-Whitney test) were observed by real time RT-PCR. A trend in higher median IC of Ob was observed in CR pts (17.0 pmole/mg protein; range 1.5–30.0) as compared to NR pts (4.4 pmole/mg protein; range 0.33–28.0) (P=.06; Mann-Whitney test). Six of 7 pts with IC above the median obtained a CR. No differences were observed in the Ob plasma PKs between the CR pts [median steady state concentration (Css) 2.8 μg/mL, area-under-the-curve (AUC) 772 μg*hr/mL and clearance (Cl) 9.6 L/hr) and the NR pts (median Css 3.4 μg/mL, AUC 752 μg*hr/mL, Cl 6.4 L/hr). Although the number of samples analyzed was small, our data suggest that, despite interpatient variability of both Bcl-2 mRNA expression and Ob uptake, this antisense can be successfully delivered to pts and result in clinically relevant target downregulation. A Cancer and Leukemia Group B phase III AML study to characterize prospectively the interplay of IC levels of the Ob and Bcl-2 downregulation is in progress.

Lentiviral Vector-Mediated In Vitro Down-Regulation of Porcine Somatostatin Expression Using shRNA

2011 ◽  
Vol 343-344 ◽  
pp. 1248-1254
Author(s):  
Jing Hua Ding ◽  
Qian Yun Xi ◽  
Hong Yi Li ◽  
Gang Shu ◽  
Song Bo Wang ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Lentiviral Vector ◽  
Direct Detection ◽  
Rt Pcr ◽  
Down Regulation ◽  
Rna Sequences ◽  
Nih3t3 Cells ◽  
Somatostatin Expression

Two shRNA sequences against porcine somatostatin (SST) were designed using software available on the NCBI website. The designed RNA sequences were chemically synthesized and cloned into lentiviral vectors (LV-siRNA1 and LV-siRNA2). Porcine somatostatin cDNA was amplified and cloned into pcDNA3.1 (pcDNA3.1-SST). LV-siRNA1 or LV-siRNA2 was cotransfected with pcDNA3.1-SST into NIH3T3 cells. Real-time RT-PCR for the detection of SST mRNA, revealed that LV-siRNA1 and LV-siRNA2 suppressed SST expression by 87.9% and 86.3% (P< 0.01), respectively. In addition, radioimmunoassay (RIA) for direct detection of SST indicated that the suppression ratios for LV-siRNA1 and LV-siRNA2 were 55.1% and 51.6% (P< 0.01), respectively. These data showed that the 2 shRNA sequences were effective in suppressing SST expression and may provide an approach to down-regulate bothin vitroandin vivoexpression of porcine SST.

216 HORMONAL REGULATION OF CLAUDIN-4 TIGHT JUNCTION MOLECULE IN MOUSE PLACENTA

2015 ◽  
Vol 27 (1) ◽  
pp. 198
Author(s):  
C. Ahn ◽  
D. Lee ◽  
E.-B. Jeung
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Tight Junctions ◽  
Western Blotting ◽  
Hormonal Regulation ◽  
Paracellular Transport ◽  
Rt Pcr ◽  
Ionic Selectivity ◽  
Mouse Placenta ◽  
Transport Barriers

Tight junctions (TJ) are composed of a branching network of sealing strands. TJ regulate paracellular conductance and ionic selectivity. TJ components include the peripheral protein ZO-1, junctional adhesion molecules (JAM) and the integral proteins such as occludin and claudin. Claudins are a family of proteins that are the most important components in the tight junctions. The established paracellular transport barriers that control transportation of molecules within intercellular space. The present study focused on the expression of claudin, suggesting as major working molecules in the paracellular transport system. To study the regulation and roles of claudin family, we examined expression of mouse placental claudin family. Fifteen pregnant C57/BL6 mice were used in this study and TJ proteins including Claudin-1 to Claudin-24 expressions by real-time RT–PCR and Western blotting. The mice were divided into 3 groups depending on the gestational day (on Days 12, 16, and 20 of gestation).The localization of TJ proteins were examined by immunohistochemistry. After we identified the fluctuation of claudin expression during pregnancy, we assumed that the hormones are one regulator for claudin family. Therefore, we performed an in vivo study with hormone receptor antagonists (ICI 182, 780, and RU-486) for examining hormonal effect on claudin expression in the placenta. Forty-nine mice were divided into 7 groups. The changes of claudin expression were examined with real-time RT-PCR and Western blotting. In the transcription levels, Claudin-1, claudin-2, claudin-4, and Claudin-5 expression levels were relatively high compared to others in the claudin family in all periods of the pregnancy. The claudin-4 expression, which reduces permeability of ions, increased over a period of time. However, caludin-5 expression that is the responsive protein for a decrease in paracellular conductance, were decreased. Claudin-1 and -4 have been known as responsive genes for a decrease in paracellular conductance. On the other hand, claudin 2 and 5 have been known as increasing paracellular conductance. In addition, immunohistochemistry was performed to identify their localization for inferring permeability in placenta. In summary, we analysed the claudin expressions and presented possible important claudins among its family. Furthermore, their localization was also examined in the mouse placenta. In addition, the regulation of critically expressed claudins by pregnancy-associated hormones, E2 and P4, was examined. These results may provide functional and structural roles of claudins and their involvement in the maternal-fetal interaction and in the transportation of placental materials.

Micrornas Promote Activation and Maturation of Natural Killer Cells Through Toll-Like Receptor Signaling.

Blood ◽  
2012 ◽  
Vol 120 (21) ◽  
pp. 2160-2160 ◽  
Author(s):  
Jianhua Yu ◽  
Shun He ◽  
Lai-Chu Wu ◽  
Hsiaoyin Mao ◽  
Sumithira Vasu ◽  
...  
Keyword(s):  
Nk Cells ◽  
Real Time ◽  
Cell Activation ◽  
Nk Cell ◽  
Cell Maturation ◽  
Toll Like Receptor ◽  
Rt Pcr ◽  
Tlr Signaling ◽  
Healthy Donors

Abstract Abstract 2160 Introduction: MicroRNAs (miRNAs) are short ribonucleic acids, which consist of an average of 22 nucleotides, and bind to complementary sequences of target mRNAs to result in translational repression or target degradation, thus silencing gene expression. MiRNAs can be abundantly found in circulating blood, yet whether, as a class of regulatory molecules, they may interact with innate immune natural killer (NK) cells has not been explored. Methods: Human NK cells were first enriched from the peripheral blood of healthy donors by negative selection using RosetteSep NK cell enrichment cocktail, followed by positive selection using anti-CD56 microbeads. After purity of ≥ 99% was confirmed by flow cytometry, NK cells were used for experiments. After being isolated from healthy donor serum by ExoQuick Exosome precipitation and verified by immunoblotting for CD9 expression, exosomes were assessed for miRNA content via real-time reverse-transcriptase (RT)-PCR using TaqMan miRNA assays. Purified NK cells were stimulated with either whole exosomes or miRNAs complexed with DOTAP, a liposomal transfection reagent. Downstream activation of Toll-like receptor (TLR) signaling by miRNAs was measured via immunoblotting for NF-kB, and its inhibition was similarly assayed in the presence of TLR blocking antibodies. Flow cytometry was used to assess NK cell activation (via CD69 surface expression) and NK cytotoxicity against tumor cells (in a CD107a degranulation assay). IFN-g production was measured via Real-time RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). For in vivo stimulation, a complex consisting of miRNAs and Lipofectamine 2000 was administered by tail-vein injection. NK cell activation was then measured using the aforementioned in vitro assays. After in vivo stimulation with miRNAs, which was performed in the presence of NK cells or following NK depletion by TM-β1 (IL-2/15Rβ) mAb, development of implanted lymphoma tumor cells was monitored by bioluminescent imaging. NK cells purified from lymphoma patients and from healthy donors were assessed for expression of the NF-kB signaling component, p65, and TLRs via real-time RT-PCR. NK cell maturation was analyzed by flow cytometric staining for surface receptors, such as CD56 and CD94, indicative of NK cell maturation. Results: We found that, in the presence of a low dose IL-12, treatment of human NK cells with several mature miRNAs induced CD69 expression, IFN-g production, and expression of the degranulation marker, CD107a. MiRNA-containing exosomes freshly isolated from normal human donors were also able to activate NK cells, even in the absence of IL-12. In vivo, infusion of several miRNAs into the peripheral blood similarly activated murine NK cells, while T cells were not activated. Furthermore, miRNA administration significantly protected mice from developing tumors, and this occurred in an NK cell-dependent manner. Interestingly, miRNAs also augmented expression of surface markers associated with NK cell maturation, such as CD56 and CD94, suggesting that miRNAs may play a role in promoting NK cell maturation. Mechanistically, we found that stimulation with miRNAs led to downstream activation of NF-kB. This effect was blunted upon blockade of TLR (e.g. TLR1) signaling, and was attenuated in lymphoma patients. Conclusion: Collectively, we provide the first evidence that extrinsic miRNAs, as a class of regulatory molecules, directly activate and may also promote the maturation of NK cells. These effects on NK cell activation and maturation are mediated, at least in part, by the TLR signaling pathway. This phenomenon may be important for normal host defense against infection and/or malignant transformation. Our studies indentify a new function of miRNAs with physiological relevance, and their potential for applications in preventing or treating cancer and infections either alone or as an adjuvant. Disclosures: Jaglowski: Pharmacyclics: Research Funding.

Mechanisms of polymicrobial sepsis-induced ileus

2004 ◽  
Vol 287 (3) ◽  
pp. G685-G694 ◽  
Author(s):  
Marcus Overhaus ◽  
Sandra Tögel ◽  
Michael A. Pezzone ◽  
Anthony J. Bauer
Keyword(s):  
Nitric Oxide ◽  
Nitric Oxide Synthase ◽  
Real Time ◽  
Inducible Nitric Oxide Synthase ◽  
Gastrointestinal Transit ◽  
Polymicrobial Sepsis ◽  
Rt Pcr ◽  
Oxide Synthase ◽  
Inducible Nitric Oxide

Sepsis frequently occurs after hemorrhage, trauma, burn, or abdominal surgery and is a leading cause of morbidity and mortality in severely ill patients. We performed experiments to delineate intestinal molecular and functional motility consequences of polymicrobial sepsis in the clinically relevant cecal ligation and puncture (CLP) sepsis model. CLP was performed on male Sprague-Dawley rats. Gastrointestinal transit, colonic in vivo pressure recordings, and in vitro muscle contractions were recorded. Histochemistry was performed for macrophages, monocytes, and neutrophils. Inflammatory gene expressions were quantified by real-time RT-PCR. CLP delayed gastrointestinal transit, decreased colonic pressures, and suppressed in vivo circular muscle contractility of the jejunum and colon over a 4-day period. A leukocytic infiltrate of monocytes and neutrophils developed over 24 h. Real-time RT-PCR demonstrated a significant temporal elevation in IL-6, IL-1β, monocyte chemoattractant protein-1, and inducible nitric oxide synthase, with higher expression levels of IL-6 and inducible nitric oxide synthase in colonic extracts compared with small intestine. Polymicrobial CLP sepsis induces a complex inflammatory response within the intestinal muscularis with the recruitment of leukocytes and elaboration of mediators that inhibit intestinal muscle function. Differences were elucidated between endotoxin and CLP models of sepsis, as well as a heterogeneous regional response of the gastrointestinal tract to CLP. Thus the intestine is not only a source of bacteremia but also an important target of bacterial products with major functional consequences to intestinal motility and the generation of cytokines, which participate in the development of multiple organ failure.

scholarly journals Διερεύνηση του ρόλου των αδρενεργικών και ντοπαμινεργικών συστημάτων στη ρύθμιση των κυτοχρωμάτων CYP3A1/2, CYP2C11 και CYP2D1/2

2012 ◽  
Author(s):  
Ευάγγελος-Παναγιώτης Δασκαλόπουλος
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Real Time ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

Τα ηπατικά κυτοχρώματα CYPs (P450s) είναι μια μεγάλη υπερ-οικογένεια πρωτεϊνών, οι οποίες εντοπίζονται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Η σημασία τους είναι τεράστια, αφού μεταβολίζουν μια τεράστια ποικιλία ενδογενών ουσιών αλλά και ξενοβιοτικών. Οι πιο σημαντικές υποοικογένειες κυτοχρωμάτων CYP είναι η CYP3A, η CYP2C και η CYP2D, εξαιτίας του ρόλου τους στο μεταβολισμό της πλειονότητας των πιο συχνά συνταγογραφούμενων φαρμάκων. Η γνώση όσον αφορά τους παράγοντες, που μπορούν να προκαλέσουν επαγωγή ή αναστολή των κυτοχρωμάτων CYP είναι εξαιρετικής σημασίας, αφού κάθε μεταβολή στην έκφραση και την δραστικότητά τους μπορεί να έχει σοβαρότατες συνέπειες στην αποτελεσματικότητα της φαρμακευτικής αγωγής αλλά και στην φαρμακοτοξικότητα. Η αναστολή των ηπατικών CYPs μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένα επίπεδα ενός φαρμάκου-υποστρώματος στο πλάσμα και στην ανάπτυξη τοξικών εκδηλώσεων. Αντίθετα, η επαγωγή των CYPs μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη αποτελεσματικότητα ή ακόμη και πλήρη αποτυχία της φαρμακοθεραπείας. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση στον επίμυ της επίδρασης του στρες στη ρύθμιση της έκφρασης των πιο σημαντικών για τον μεταβολισμό φαρμάκων κυτοχρωμάτων, των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Επίσης, διερευνήθηκε ο ρόλος των αδρενεργικών υποδοχέων, των γλυκοκορτικοειδών καθώς και των μονοπατιών μεταγωγής σήματος (cAMP/PKA, JNK, GH/STAT5b) στη ρύθμιση των ανωτέρω κυτοχρωμάτων. Μελετήθηκε επίσης, ο ρόλος των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP γονιδίων καθώς και η συμμετοχή του μονοπατιού μεταγωγής σήματος PI3K/Akt/FoxO1, αλλά και του μεταγραφικού παράγοντα STAT5b. Για την ερευνητική προσέγγιση αυτών των θεμάτων, έγιναν τόσο in vivo πειράματα με ενήλικες αρσενικούς επίμυες, όσο και in vitro πειράματα με καλλιέργειες πρωτογενών ηπατοκυττάρων, που απομονώθηκαν από το ήπαρ επιμύων. Οι μέθοδοι, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν συμπεριλαμβάνουν την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) για την μέτρηση την ενζυμικής δραστικότητας των υπό μελέτην CYP3A, CYP2C και CYP2D, την ανοσοαποτύπωση κατά Western για την εκτίμηση των μεταβολών σε επίπεδο αποπρωτεΐνης, καθώς και την μέθοδο real-time polymerase chain reaction (RT-PCR, q-PCR) για την ποσοτική εκτίμηση των επιπέδων mRNA των ανωτέρω CYP γονιδίων. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης κατέδειξαν ότι το ψυχολογικό στρες είναι ένας παράγοντας τεράστιας σημασίας για τη ρύθμιση της έκφρασης των CYPs. Πιο συγκεκριμένα, το στρες της μητρικής αποστέρησης, στο οποίο εκτέθηκαν οι επίμυες σε πολύ μικρή ηλικία προκάλεσε την αύξηση της έκφρασης των CYP3A1/2 και CYP2C11, ενώ το CYP2D δεν επηρεάστηκε σημαντικά. Αντιθέτως, το στρες περιορισμού προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του CYP3A2, του CYP2D και μικρότερες μεταβολές στο CYP2A. Επιπροσθέτως, επιβεβαιώθηκε η επαγωγική δράση των γλυκοκορτικοειδών στο CYP3A και η κατασταλτική τους δράση στο CYP2C. Σημαντικά ευρήματα μετά από in vivo και in vitro πειράματα, τα οποία επικεντρώθηκαν στη μελέτη των αδρενεργικών μονοπατιών φανέρωσαν ότι τα μονοπάτια cAMP/PKA, JNK και του άξονα GH/STAT5b διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs. Η συμμετοχή των πυρηνικών υποδοχέων PXR, RXR και HNF4α φαίνεται να είναι σημαντική στις μεταβολές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση αυτών των CYPs. Eπιπλέον, η αναστολή των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων in vivo, οδήγησε σε μεγάλη καταστολή των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Αντιθέτως, αναστολή των ηπατικών D2-υποδοχέων in vitro, οδήγησε σε επαγωγή αυτών των CYPs. Αυτό το εύρημα οδήγησε στην υπόθεση ότι η ινσουλίνη πιθανόν διαδραματίζει στρατηγικής σημασίας ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs, αφού αποδείχθηκε ότι η αναστολή in vivο των D2-υποδοχέων ενεργοποιεί το ινσουλινοεξαρτώμενο μονοπάτι PI3K/Akt, ενώ περαιτέρω έρευνες έδειξαν τον FoxO1 ως τελικό μεταγραφικό παράγοντα ρύθμισης. Παράλληλα, ο άξονας GH/STAT5b φαίνεται να παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο και στην περίπτωση των D2-ντοπαμινεργικών μονοπατιών. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε ότι το στρες, τα γλυκοκορτικοειδή και αγωνιστές αδρενεργικών υποδοχέων αποτελούν παράγοντες, που πρέπει πάντα να λαμβάνονται υπόψιν πριν τη συνταγογράφηση σε ασθενείς. Επιπλέον, η μελέτη αυτή κατέδειξε για πρώτη φορά την επίδραση των παγκρεατικών D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων και του μονοπατιού PI3K/Akt/FoxO1 στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Διαπιστώθηκε επίσης, η συμμετοχή της GH, της PRL και των θυρεοειδικών ορμονών στις μεταβολές που προκάλεσαν οι φαρμακολογικοί χειρισμοί των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων.

scholarly journals Μελέτη του ρόλου των συστατικών του μεταβολικού μονοπατιού της HDL στην παθογένεια της οστεοπόρωσης και της οστεοαρθρίτιδας

2017 ◽  
Author(s):  
Ελένη Καλυβιώτη
Keyword(s):  
Western Blot ◽  
High Density Lipoprotein ◽  
Real Time ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Rt Pcr ◽  
Knock Out

Εισαγωγή: Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι διαταραχές στον λιπιδικό μεταβολισμό επηρεάζουν τη λειτουργία των κυττάρων του οστού με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση (ΟΠ). Η ΟΠ αποτελεί μια κοινή μεταβολική διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από μειωμένη οστική μάζα και σταδιακή επιδείνωση της μικροαρχιτεκτονικής δομής του οστίτη ιστού. Επακολούθως, οι ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων. Τα τελευταία χρόνια αρκετές μελέτες ανέδειξαν την ύπαρξη μιας ισχυρής σύνδεσης μεταξύ του οστικού και λιπιδικού μεταβολισμού. Επιπλέον, τόσο η ομάδα μας όσο και άλλοι ερευνητές έχουν δείξει ότι διαταραχές στο μεταβολισμό της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (High Density Lipoprotein-HDL) ενέχονται στην εμφάνιση μεταβολικών νοσημάτων, όπως είναι η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο της HDL στον μεταβολισμό των λιπιδίων στο πλάσμα και στους ιστούς και οδηγούμενοι από τα ευρήματα της δικής μας ομάδας αλλά και άλλων ερευνητών, στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε το ρόλο της απολιποπρωτεΐνης Α1 (APOA1), βασικού συστατικού του μονοπατιού βιοσύνθεσης της HDL, στη ρύθμιση της λειτουργίας των κυττάρων του οστού και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικών.Μεθοδολογία: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της ApoA1 (ApoΑ1-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου). Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Πριν την ευθανασία λήφθηκε πλάσμα αίματος και ακολούθως τα ζώα θυσιάστηκαν. Από τα πειραματόζωα απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογικές, ιστομορφομετρικές, εμβιομηχανικές και in vitro αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού (στατική ιστομορφομετρία). Με τη χρώση TRAP και τη χρώση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών, ενώ αναλύθηκαν και οι εμβιομηχανικές ιδιότητες του οστού (αντοχή σε θραύση, ελαστικότητα κλπ) με τη χρήση του 3-point bending, στις δύο ομάδες πειραματόζωων. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα (MSC) του μυελού των οστών απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση της έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική (RUNX2, OSX, COL1A1) και στην οστεοκλαστική λειτουργία (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ) καθώς και στην λιπογένεση (PPARγ, CEBPA). Επίσης, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολικό μονοπάτι της χοληστερόλης (ApoA2, Ggps, Hmgcr, Hdlbp, Fdps1, Cpt1a, Scarb1), αλλά και των γονιδίων που σχετίζονται με τη διατήρηση και την κινητοποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων (Ptprc, Sca-1, Cxcl12, Cxcr4, Anxa2). Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη real time RT-PCR. Αποτελέσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της οστικής μάζας στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα ποντίκια αγρίου τύπου. Η έκφρασης της ACTH ήταν όμοια και στις δυο ομάδες ζώων, ενώ τα επίπεδα mRNA του Scarb1 ήταν σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Τα αποτελέσματα της στατικής και δυναμικής ιστομορφομετρίας έδειξαν ότι η μειωμένη οστική μάζα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια αντικατοπτρίζει τη μειωμένη οστική σύνθεση. Η ανάλυση της βιοχημικής σύνθεσης και των εμβιομηχανικών ιδιοτήτων των μηριαίων οστών, έδειξε ότι αυτές οι παράμετροι ήταν διαταραγμένες στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα αγρίου τύπου ποντίκια. Επιπρόσθετα, η επαγωγή διαφοροποίησης των MSC, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, από τα ΑpoΑ1-/- ποντίκια φαίνεται να εμφανίζει μειωμένη παραγωγή οστεοβλαστών και αυξημένη παραγωγή λιποβλαστών σε αντίθεση με τα MSC από αγρίου τύπου ποντίκια. Αυτό φανερώνει την ύπαρξη μιας μετατόπισης στην ισορροπία της διαδικασίας διαφοροποίησης των MSC, η οποία ευνοεί την λιπογένεση. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συμφωνία με την αρχική ιστολογική παρατήρηση της ύπαρξης αυξημένων λιποκυττάρων στο μυελό των οστών των ΑpoΑ1-/- ποντικιών σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου. Αντίθετα με τα ευρήματα για τη δυσλειτουργία των οστεοβλαστών, η οστεοκλαστική διαφοροποίηση in vitro και η μέτρηση της οστεοκλαστικής επιφάνειας in vivo εμφανίζονται ανεπηρέαστες. Επιπρόσθετα, σε ολικά κύτταρα του μυελού των οστών, σε συμφωνία με τα αυξημένα λιποκύτταρα και τα δεσμευμένα προς λιποβλάστες αρχέγονα MSC, τα επίπεδα έκφρασης του PPARγ είναι στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Ακόμα, στο μυελό των οστών στα apoΑ1-/- ποντίκια η έκφραση της κυτταροκίνης CXCL12 είναι μειωμένη, ενώ του CXCR4 αυξημένη, στοιχεία που συμφωνούν με μειωμένη σηματοδότηση στο μονοπάτι που εμπλέκεται στη διατήρηση των MSC (homing) και την οστεοβλαστική διαφοροποίηση. Επιπλέον, στα ApoΑ1-/- ποντίκια παρατηρείται σημαντική μείωση στους παράγοντες που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και λειτουργία των οστεοβλαστών, όπως είναι ο RUNX2, ο OSX και ο COL1A1. Ενώ, επίσης τα knock out ποντίκια εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του παράγοντα CEPBa, υποδηλώνοντας την ύπαρξη πολύπλοκων αλλαγών στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση που απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.Συμπεράσματα: Η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε ελάττωση της οστικής μάζας, κυρίως λόγω μειωμένης λειτουργίας των οστεοβλαστών. Επιπλέον, η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε αύξηση της λιπογένεσης και μείωση της οστεοβλαστογένεσης, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε ελαττωματική σύνθεση οστού, ενώ παράλληλα η δράση των οστεοκλαστών παραμένει ανεπηρέαστη. Τα αποτελέσματα μας, για πρώτη φορά, αναδεικνύουν ότι η APOA1 ρυθμίζει τη λειτουργία των οστεοβλαστών και των λιποβλαστών και αυξάνει την πιθανότητα ότι η APOA1 μπορεί να δράσει ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης και άλλων μεταβολικών νοσημάτων.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document