Penelitian bertujuan untuk mengetahui pengaruh lama penyimpanan semen ayam cemani terhadap moltilitas dan daya hidup spermatozoa pada pengencer ringer laktat kuning telur yang disimpan pada suhu 4°C. Penelitian ini menggunakanRancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tujuhkelompok perlakuan lama penyimpanan, yaituT0 = penyimpanan selama 0 jam, T1= penyimpanan selama 12 jam, T2 = penyimpanan selama 24 jam, T3 = penyimpanan selama 36 jam, T4 = penyimpanan selama 48 jam, T5 = penyimpanan selama 60 jam, T6 = penyimpanan selama 72 jam. Variabel yang diamatiberupamotilitas progresif (%)dan daya hidup spermatozoa (%). Motilitas diamati secara subyektif di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400kali,sedangkan daya hidup diamati dengan pengecatan eosin-nigrosin. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak empatkali.Data yang diperoleh dianalisisdengan uji sidik ragamdan apabila terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa lama penyimpanan berpengaruh nyataterhadap motilitas dan daya hidup sperma.Setelah 70 jam penyimpanandidapatkan motilitas spermatozoa 42,00±0,8% dandaya hidup 44,00±0,82%.Pada penelitian ini dapat disimpulkan bawa lama penyimpanan semen ayam cemani menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur pada suhu 4º C masih layak digunakan selama 60 jam penyimpanan dengan motilitas 46,00±0,81% dandaya hidup 50,75±0,96%.