Πρωτεϊνική μηχανική του ενζύμου L-ασπαραγινάση
Το ένζυμο L-ασπαραγινάση καταλύει την μετατροπή της L-ασπαραγίνης σε L-ασπαραγινικό οξύ και αμμωνία. Η ενδοφλέβια χορήγηση του ενζύμου που έχει απομονωθεί από τα βακτήρια Erwinia chrysanthemi και Escherichia coli έχει αποδειχθεί πολύ αποτελεσματική στις περισσότερες των περιπτώσεων λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας. Η αποτελεσματικότητα του ενζύμου, οι φαρμακοκινητικές ιδιότητες και οι διαφορετικές παρενέργειες που εκδηλώνονται κατά τη θεραπευτική αγωγή έχει βρεθεί ότι εξαρτώνται από την πηγή προέλευσης και την μέθοδο καθαρισμού του. Σκοπός της μελέτης είναι η ανάπτυξη μίας ολοκληρωμένης μεθόδου παραγωγής του ενζύμου L-ασπαραγινάση σε ανασυνδυασμένα κύτταρα E. coli και η δημιουργία τροποποιήσεων στο ένζυμο, ώστε να προκύψουν ανασχεδιασμένες μορφές με επιθυμητές ιδιότητες. Γενωματικό DNA από τα βακτήρια Erwinia carotovora και Erwinia chrysanthemi απομονώθηκε και χρησιμοποιήθηκε σαν μήτρα για την αναπαραγωγή των κωδικών αλληλουχιών του γονιδίου της L-ασπαραγινάσης, οι οποίες κλωνοποιήθηκαν και τα ένζυμα εκφράστηκαν σε κύτταρα E coli BL21(DE3)pLysS. Ακολούθως πραγματοποιήθηκαν μελέτες με στόχο να χαρακτηριστούν τα ετερόλογα παραγόμενα ένζυμα. Επειδή η L-ασπαραγινάση είναι βακτηριακής προέλευσης, όταν χορηγείται στον άνθρωπο αναγνωρίζεται από τις πρωτεάσες του αίματος και πέπτεται. Με στόχο να δημιουργηθεί ανασχεδιασμένη μορφή της EcaL-Asnase με ανθεκτικότητα στη δράση της θρυψίνης, το ένζυμο τροποποιήθηκε χημικά με ηλεκτριναμικούς εστέρες της πολυαιθυλενογλυκόλης και μεταλλάχθηκε με εφαρμογή κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης. Οι τροποποιημένες μορφές που προέκυψαν μελετήθηκαν και η τελική ανασχεδιασμένη μορφή είχε τα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Για τη δημιουργία in vitro εξελικτικά ανασχεδιασμένης μορφής του ενζύμου με επιθυμητές αλλαγές στις ιδιότητες του, πραγματοποιήθηκε κατευθυνόμενος εξελικτικός ανασχεδιασμός του ενζύμου L-ασπαραγινάση με τη διαδικασία της περιορισμένης επιμήκυνσης. Τελικός στόχος ήταν να βρεθούν κλώνοι με μειωμένη συγγένεια και δραστικότητα για το υπόστρωμα L-Gln, καθώς επίσης και κλώνοι με αυξημένη θερμοσταθερότητα. Επιλέχθηκαν δύο κλώνοι με μειωμένη δραστικότητα L-γλουταμινάσης (L90I, G281S) και ένας κλώνος με αυξημένη θερμοσταθερότητα (D133V). Οι μεταλλαγμένες μορφές μελετήθηκαν και τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι μορφές L90I και G281S δεν αναγνώριζαν πλέον την L-γλουταμίνη ως υπόστρωμα. Η δε D133V εμφανίστηκε ιδιαίτερα θερμοσταθερή. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος του καταλοίπου στη θέση 133 όσον αφορά στην αύξηση της θερμοανθεκτικότητας του ενζύμου, πραγματοποιήθηκε μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση αυτή. Από τη βιβλιοθήκη που προέκυψε επιλέχθηκαν πέντε κλώνοι, των οποίων η μελέτη έδειξε πως η αμινοξική θέση 133 παίζει σημαντικό ρόλο στη σταθερότητα του ενζύμου, αλλά υπάρχουν και άλλα αμινοξικά κατάλοιπα τα οποία συνεισφέρουν στην ιδιότητά του αυτή.