Comprehensive analyses of the inotropic compound omecamtiv mecarbil in rat and human cardiac preparations

Omecamtiv mecarbil (OM), a myosin activator, was reported to induce complex concentration- and species-dependent effects on contractile function and clinical studies indicated a low therapeutic index with diastolic dysfunction at concentrations above 1 µM. To further characterize effects of OM in a human context and under different preload conditions, we constructed a setup that allows isometric contractility analyses of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived engineered heart tissues (EHTs). The results were compared to effects of OM on the very same EHTs measured under auxotonic conditions. OM induced a sustained, concentration-dependent increase in time-to-peak under all conditions (maximally 2-3 fold). Peak force, in contrast, was increased by OM only in human, but not rat EHTs and only under isometric conditions, varied between hiPSC lines and showed a biphasic concentration-dependency with maximal effects at 1 µM. Relaxation time tended to fall under auxotonic and strongly increase under isometric conditions, again with biphasic concentration-dependency. Diastolic tension concentration-dependently increased under all conditions. The latter was reduced by an inhibitor of the mitochondrial sodium calcium exchanger (CGP-37157). OM induced increases in mitochondrial oxidation in isolated cardiomyocytes, indicating that OM, an inotrope that does not increase intracellular and mitochondrial Ca2+, can induce mismatch between an increase in ATP and ROS production and unstimulated mitochondrial redox capacity. Taken together, we developed a novel setup well suitable for isometric measurements of EHTs. The effects of OM on contractility and diastolic tension are complex with concentration-, time-, species- and loading-dependent differences. Effects on mitochondrial function require further studies.

The RyR2-R2474S Mutation Sensitizes Cardiomyocytes and Hearts to Catecholaminergic Stress-Induced Oxidation of the Mitochondrial Glutathione Pool

Missense mutations in the cardiac ryanodine receptor type 2 (RyR2) characteristically cause catecholaminergic arrhythmias. Reminiscent of the phenotype in patients, RyR2-R2474S knockin mice develop exercise-induced ventricular tachyarrhythmias. In cardiomyocytes, increased mitochondrial matrix Ca2+ uptake was recently linked to non-linearly enhanced ATP synthesis with important implications for cardiac redox metabolism. We hypothesize that catecholaminergic stimulation and contractile activity amplify mitochondrial oxidation pathologically in RyR2-R2474S cardiomyocytes. To investigate this question, we generated double transgenic RyR2-R2474S mice expressing a mitochondria-restricted fluorescent biosensor to monitor the glutathione redox potential (EGSH). Electrical field pacing-evoked RyR2-WT and RyR2-R2474S cardiomyocyte contractions resulted in a small but significant baseline EGSH increase. Importantly, β-adrenergic stimulation resulted in excessive EGSH oxidization of the mitochondrial matrix in RyR2-R2474S cardiomyocytes compared to baseline and RyR2-WT control. Physiologically β-adrenergic stimulation significantly increased mitochondrial EGSH further in intact beating RyR2-R2474S but not in RyR2-WT control Langendorff perfused hearts. Finally, this catecholaminergic EGSH increase was significantly attenuated following treatment with the RyR2 channel blocker dantrolene. Together, catecholaminergic stimulation and increased diastolic Ca2+ leak induce a strong, but dantrolene-inhibited mitochondrial EGSH oxidization in RyR2-R2474S cardiomyocytes.

The interplay between inflammasome activation, mitochondrial oxidation and bacterial burden in Interstitial Lung Diseases

Οι Διάχυτες Διάμεσες Πνευμονοπάθειες(ΔΔΠ) και πιο συγκεκριμένα η Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση (ΙΠΙ) είναι νοσήματα με μεγάλη ετερογένεια όσον αφορά την πρόοδο νόσου καθώς και την ανταπόκριση στην θεραπεία. Στοιχεία πρόσφατων ερευνών έχουν αποκαλύψει κοινά παθογενετικά μονοπάτια στις διαφορετικές ινωτικές διάμεσες πνευμονοπάθειες που οδηγούν στην έναρξη και πρόοδο της ίνωση. Τα μακροφάγα και τα μονοκύτταρα ελέγχουν την ισορροπία μεταξύ επούλωσης και ίνωσης μετά από κάποιο ερέθισμα στους ιστούς. Στους πνεύμονες τα κυψελιδικά μακροφάγα είναι κύτταρα εμβρυικής προελεύσεως με αντι-φλεγμονώδης και αντι-ινωτικες δράσεις και η λειτουργία τους αποσκοπεί στην διατήρηση της ισορροπίας. Μετά από ένα ινωτικό ή φλεγμονώδες ερέθισμα, μονοκύτταρα από τον μυελό τον οστών επιστρατεύονται στους πνεύμονες και παίρνουν χαρακτήρες κυψελιδικών μακροφάγων. Αυτού του είδους τα μονοκύτταρα/μακροφάγα είναι περισσότερο φλεγμονώδη και ινωτικά και έχουν συσχετισθεί με την παθογένεια της ίνωσης. Το φλεγμονόσωμα είναι ενας από τους κεντρικούς μηχανισμούς με τους οποίους τα μακροφάγα παράγουν κυτταροκίνες. Πρόκειται για κυττοσολικά σύμπλοκα πρωτεϊνών που δρουν ως αισθητήρες του ανοσοποιητικού συστήματος. Ο ρόλος τους είναι να μετατρέπουν και να απελευθερώνουν την κυτταροκίνη IL-1β στην ενεργή της μορφή. Η IL-1β είναι μία ισχυρή προ-φλεγμονώδη κυτταροκίνη που έχει συσχετισθεί με οξεία πνευμονική βλάβη και ίνωση. Το NLRP3, το πιο γνωστό φλεγμονόσωμα, ενεργοποιείται από μια ποικιλία ερεθισμάτων συμπεριλαμβανομένων των ATP, nigericin και ROS. Το AIM2 φλεγμονοσωμα ενεργοποιείται από το ελεύθερο δίκλωνο DNA (dsDNA) και το NLRC4 από το μαστίγιο τον βακτηρίων. Αρκετοί παράγοντες ενεργοποίησης των φλεγμονοσωμάτων έχουν αναγνωριστεί ως πιθανοί παθογενετικοί παράγοντες στην ίνωση των πνευμόνων.Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και η επακόλουθη οξείδωση των μιτοχονδρίων θεωρείται ένα από τα βασικά παθογενετικά μονοπάτιατης ΙΠΙ. Επιπλέον, αλλαγές στο μικροβίωμα έχουν συσχετισθεί με την παθογένεια της νόσου, καθώς η υπερανάπτυξη συγκεκριμένων μικροβιακών ειδών επηρεάζει την πρόοδο της ίνωσης και την απελευθέρωση συγκεκριμένων κυτταροκινών από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Σε αυτήν τη μελέτη υποθέσαμε ότι τα φλεγμονόσωματτα είναι υπερ-ενεργοποιημένα στα κυψελιδικά μακροφάγα ασθενών με ίνωση, ως αποτέλεσμα της μιτοχονδριακής οξείδωσης και της διαταραχής του μικροβιώματος. Στην συγκεκριμένη προοπτική μελέτη συμπεριλήφθηκαν ασθενείς με ίνωση των πνευμόνων (τόσο ασθενείς με ΙΠΙ όσο και ασθενείς με ίνωση διαφορετικής της ΙΠΙ) και υγιείς μάρτυρες. Οι ασθενείς υπεβλήθησαν σε βρογχοσκόπηση και λάβαμε το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BALF). Από το έκπλυμα απομονώθηκαν τα κυψελιδικά μακροφάγα που στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με σκοπό την ενεργοποίηση των Φλεγμονοσωμάτων, NLRP3, AIM2 και NLRC4. Παράλληλα, μετρήθηκε το μιτοχονδριακό ROS στα μακροφάγα και μικροβιακό φορτίο στο κυψελιδικό έκπλυμα.Δεν υπήρξε αξιοσημείωτη διαφορά στη βασική ενεργοποίηση των φλεγμονοσωμάτων στην πνευμονική ίνωση. Ωστόσο, μετά από ενεργοποίηση, το NLRP3 μπορούσε να υπερ-ενεργοποιηθεί στην ΙΠΙ και στα άλλα ΔΔΠ, σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Η ενεργοποίηση του AIM2 ήταν επίσης πιο επαγώγιμη στην ΙΠΙ σε σύγκριση με τους μάρτυρες, με παρόμοιες τάσεις να παρατηρούνται στα άλλα ΔΔΠ. Η ενεργοποίηση του NLRC4 ήταν παρόμοια μεταξύ των ομάδων. Η μιτοχονδριακή οξείδωση(mtROS) συσχετίστηκε σημαντικά με αυξημένη ενεργοποίηση τόσο του NLRP3 όσο και του AIM2 φλεγμονοσώματος. Η ενεργοποίηση του NLRP3 προκαλεί μια έκρηξη μιτοχονδιακού ROS, το οποίο μπορούσε να ανασταλεί έπειτα από μιτοχονδριακή αντιοξειδωτική θεραπεία. Παρομοίως, η αντιοξειδωτική θεραπεία αναστέλλει την ενεργοποίηση του φλεγμονώματος και την απελευθέρωση της IL-1β. Το μικροβιακό φορτίο μετρήθηκε στους ασθενείς με ΔΔΠ και ΙΠΙ και το επίπεδο του σχετιζόταν με την απελευθέρωση της IL-1β από τα καλλιεργούμενα μακροφάγα και επίσης με την έκφραση των ΑΙΜ2 και IL-18 ανεξάρτητα από το mtROS.Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη προσπάθεια χαρακτηρισμού της σχέσης μιτοχονδριακής οξείδωσης, μικροβιακού φορτίου και φλεγμονοσωμάτων σε ασθενείς με πνευμονική ίνωση. Τα παραπάνω ευρήματα υποδηλώνουν ότι υπάρχει συσχέτιση υπερ-ενεργοποίσης των Φλεγμονοσωμάτων NLRP3 και AIM2 με αυξημένη μιτοχονδριακή οξείδωση. Επιπλέον το μικροβιακό φορτίο σχετίζεται και αυτό με την σειρά του με προ-ενεργοποίηση των φλεγμονοσωμάτων στους πνεύμονες ασθενών με πνευμονική ίνωση.

Enhanced IL-1β Release Following NLRP3 and AIM2 Inflammasome Stimulation Is Linked to mtROS in Airway Macrophages in Pulmonary Fibrosis

Fibrotic Interstitial lung diseases (ILDs) are complex disorders of variable clinical behaviour. The majority of them cause significant morbidity, whilst Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is recognised as the most relentless. NLRP3, AIM2, and NLRC4 inflammasomes are multiprotein complexes driving IL-1β release; a proinflammatory and profibrotic cytokine. Several pathogenetic factors associated with IPF are identified as inflammasome activators, including increases in mtROS and bacterial burden. Mitochondrial oxidation and alterations in bacterial burden in IPF and other ILDs may lead to augmented inflammasome activity in airway macrophages (AMs). IPF (n=14), non-IPF-ILDs (n=12) patients and healthy subjects (n=12) were prospectively recruited and AMs were isolated from bronchoalveolar lavage. IL-1β release resulting from NLRP3, AIM2 and NLRC4 inflammasomes stimulation in AMs were determined and baseline levels of mitochondrial ROS and microbial burden were also measured. Our results showed that NLRP3 was more inducible in IPF and other ILDs compared to controls. Additionally, following AIM2 activation IL-1β release was significantly higher in IPF compared to controls, whereas similar trends were observed in Non-IPF-ILDs. NLRC4 activation was similar across groups. mtROS was significantly associated with heightened NLRP3 and AIM2 activation, and mitochondrial antioxidant treatment limited inflammasome activation. Importantly, microbial burden was linked to baseline IL-1β release and AIM2 and IL-18 relative expression independently of mtROS. In conclusion, the above findings suggested a link between the overactivation of NLRP3 and AIM2 inflammasomes, driven by mitochondrial oxidation, in the pathogenesis of lung fibrosis while changes in the microbiota may prime the inflammasome in the lungs.

Regulation of cold-induced thermogenesis by the RNA binding protein FAM195A

Homeothermic vertebrates produce heat in cold environments through thermogenesis, in which brown adipose tissue (BAT) increases mitochondrial oxidation along with uncoupling of the electron transport chain and activation of uncoupling protein 1 (UCP1). Although the transcription factors regulating the expression of UCP1 and nutrient oxidation genes have been extensively studied, only a few other proteins essential for BAT function have been identified. We describe the discovery of FAM195A, a BAT-enriched RNA binding protein, which is required for cold-dependent thermogenesis in mice. FAM195A knockout (KO) mice display whitening of BAT and an inability to thermoregulate. In BAT of FAM195A KO mice, enzymes involved in branched-chain amino acid (BCAA) metabolism are down-regulated, impairing their response to cold. Knockdown of FAM195A in brown adipocytes in vitro also impairs expression of leucine oxidation enzymes, revealing FAM195A to be a regulator of BCAA metabolism and a potential target for metabolic disorders.

O-GlcNAcylation is a key regulator of multiple cellular metabolic pathways

O-GlcNAcylation modifies proteins in serine or threonine residues in the nucleus, cytoplasm, and mitochondria. It regulates a variety of cellular biological processes and abnormal O-GlcNAcylation is associated with diabetes, cancer, cardiovascular disease, and neurodegenerative diseases. Recent evidence has suggested that O-GlcNAcylation acts as a nutrient sensor and signal integrator to regulate metabolic signaling, and that dysregulation of its metabolism may be an important indicator of pathogenesis in disease. Here, we review the literature focusing on O-GlcNAcylation regulation in major metabolic processes, such as glucose metabolism, mitochondrial oxidation, lipid metabolism, and amino acid metabolism. We discuss its role in physiological processes, such as cellular nutrient sensing and homeostasis maintenance. O-GlcNAcylation acts as a key regulator in multiple metabolic processes and pathways. Our review will provide a better understanding of how O-GlcNAcylation coordinates metabolism and integrates molecular networks.

Unraveling Secretory Mechanisms that Control Pentraxin 3 Secretion in Adipocytes During Inflammation

As a soluble pattern recognition receptor, Pentraxin 3 (PTX3) plays an important role in innate immunity and obesity-associated metabolic inflammation. PTX3 is abundantly expressed and secreted in adipocytes in response to lipopolysaccharide (LPS) stimulation. Appropriate regulation of PTX3 secretion is critical for maintaining inflammatory homeostasis. This study aims to unravel the mechanisms that control PTX3 secretion in adipocytes during LPS-induced inflammation. Upon 6h treatment of LPS, PTX3 expression and secretion were significantly induced in 3T3-L1 and stromal-vascular (SV) differentiated adipocytes, but to a lesser extent in SV cells or 3T3-L1 fibroblasts. However, LPSdoes not significantly stimulate PTX3 expression and secretion in macrophages. Using chemical inhibitors of conventional and unconventional protein secretion, we explored the mechanisms for controlling LPS-stimulated PTX3 secretion. 3T3-L1 adipocytes were treated with LPS for 6h in the presence or absence of various inhibitors blocking protein secretion from the Golgi complex (Monensin and Brefeldin A), mitochondrial oxidation (carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone [CCCP]), autophagy-lysosome (chloroquine and 3-methyladenine) and inflammasome (Bay 11–7082 and wedelolactone) activation, or exosome synthesis and trafficking (GW4869, manumycin A, calpeptin, and Y-27632). There were no significant effects of all inhibitors except for Monensin, Brefeldin A, and CCCP on intracellular and secreted levels of PTX3 in adipocytes. We found that Monensin and Brefeldin A significantly blocked LPS-stimulated PTX3 secretion, resulting in cellular PTX3 accumulation in adipocytes. Disrupting mitochondrial membrane potential by CCCP caused the reduction in PTX3 secretion from adipocytes. Additionally, we detected PTX3 in exosomes isolated from LPS-treated adipocytes. Inhibiting exosome synthesis by Manumycin A attenuated LPS-stimulated PTX3 secretion in both adipocyte culture media and isolated exosomes but not in the non-exosomal fraction of media, suggesting the involvement of the exosomal pathway in PTX3 secretion. However, the levels of exosomal PTX3 were significantly lower than that of the non-exosomal PTX3, and only 4.3% of secreted PTX3 was detected in the exosomal fraction of cultural media. Inhibiting the Golgi complex pathway blocked both the exosomal and non-exosomal secretion of PTX3 in adipocytes. After further fractionation of isolated crude exosomes by the iodixanol density gradient centrifugation, we showed that the majority of PTX3 was found in the non-extracellular vesicular (EV) fractions; only a small portion of secreted PTX3 overlapped with the exosomal marker CD63 in the small EV fractions. We conclude that PTX3 is secreted mainly through the conventional protein secretion pathway and minimally through the exosomal or EV pathway in response to LPS stimulation.