scholarly journals Απομόνωση σε καλλιέργειες και ανοσοϊστοχημική μελέτη των νεοπλασματικών κυττάρων σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνο

2016 ◽  
Author(s):  
Κωνσταντίνος Μπράμης
Keyword(s):  
Progenitor Cells ◽  
Salt Solution ◽  
Thermofisher Scientific ◽  
Λαπαροσκοπική Χολοκυστεκτομή

Η καλλιέργεια ηπατοκυττάρων υπήρξε πάντα δυσχερές εργαστηριακό εγχείρημα, παρά τις επίμονες προσπάθειες πολλών ερευνητών διεθνώς. Στο Πειραματικό Εργαστήριο της Α΄Προπαιδευτικής Χειρουργικής Κλινικής, τουΠανεπιστημίου Αθηνών (Δ/ντής ο καθηγητής κ. Γεώργιος Κ. Ζωγράφος), στο ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ Γ.Ν.Α Νοσοκομείο Αθηνών, οι υπεύθυνοι Βιολόγοι κ.κ. Αγάπη Κατάκη και Αναστασία Δεβετζή, ανέπτυξαν μία απολύτως αξιόπιστη και αποτελεσματική μέθοδο, την οποία και ακολουθήσαμε στην παρούσα εργασία. ΑΣΘΕΝΕΙΣ - ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙΟ σκοπός ήταν να μελετήσουμε τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών ηπατοκυττάρων σε ασθενείς με πρωτοπαθή ηπατοκυτταρικό καρκίνο(ΗΚΚ), με προοπτική τα αποτελέσματα να αποτελέσουν ένα πιθανό οδηγό στην φαρμακευτική αντιμετώπιση της νόσου. Ως γνωστόν, η συγκεκριμένη κακοήθης πάθηση του ήπατος, είναι ανθεκτική στην χημειο-ακτινοθεραπεία και η ηπατεκτομή αποτελεί σήμερα την πρώτη γραμμή θεραπείας. Για τον σκοπό αυτόν, εκτός της επιτυχούς απομόνωσης, σε μονοκαλλιέργειες φυσιολογικών και νεοπλασματικών ηπατοκυττάρων, από υγιές ηπατικό παρέγχυμα (16 μάρτυρες που υπεβλήθησαν σε λαπαροσκοπική χολοκυστεκτομή, κατόπιν έγγραφης συναινεσης) και νεοπλασματικό ιστό από 20 ασθενείς μετα ηπατεκτομή για ΗΚΚ, διενεργήθη και ανοσο-ιστοχημική μελέτη με ειδικά αντισώματα για την ολοκλήρωση της αποκάλυψης κάποιων ιδιαιτέρων χαρακτηριστικών των καρκινικών κυττάτων. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήσαμε ήταν τα Hep-Par 1, CD90, Oct ¾, CXCR4/CD184. Ένζυμα απομονώσεως για τις μονοκαλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν κολλαγενάση τύπου IV και θρυψίνη 0.25% σε EDTA. Ως θρεπτικά μέσα χρησιμοποι-ήθηκαν DNEM-HAMS F12, RPMI 1640 και το Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS).Από τον νεοπλασματικό ιστό και το υγιές παρέγχυμα τα κυτταρα διαχωρίστικαν, μέχρι την πλήρη διάσταση της μάζης, αδρανοποιήθηκαν κατάλληλακαι φιλτραρίστηκαν σε ειδικό ηθμό 70 μικρομέτρων, σύμφωνα με την μεθοδολογία του εργαστηρίου. Μετά από διαδοχικές φυγοκεντρήσεις, εκπλύσειςκαι εναιωρήσεις, τα ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν με τριπλή φυγοκέντρηση113 στις 700 σ.α.λ. γιά 12΄. Η κυτταρική συγκομιδή και η βιωσιμότητα των απομονωθέντων ηπατοκυττάρων εκτιμήθηκε με Tryptan blue και 7-ΑΑD.Tόσο τα καρκινικά, όσο και τα υγιή ηπατοκύτταρα εναιωρήθηκαν εκ νέου και προστέθηκαν ανθρώπινη ινσουλίνη, μείγμα Pen/Strept, γενταμυκίνη και L-γλουταμίνη. Η απόδοση των ηπατοκυττάρων εκτιμήθηκε με καταμέτρηση κατά Neubauer. 2Χ10(5) ηπατοκύτταρα τοποθετήθηκαν σε 24 επικαλυμμένους δοκιμαστικούς σωλήνες και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 48 ώρες. Ακολούθως αναρροφήθηκαν προσεκτικά και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα καλλιεργείας ηπατοκυττάρων για άλλες 16 ώρες για σταθεροποίηση. Η τελική μέτρηση έγινε με κυτταρομετρία ροής ηπατοκυττάρων.΄Ολα τα ηπατοκύτταρα καρκινικά και μή, όπως και τα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία συλλογής, έκπλυσης και φυγοκέντρη-σης, ώστε το ηπατικό ίζημα να δεχθεί τριπλή ανοσο-ιστοχημική χρώση με αντι-ανθρώπινη αλβουμίνη FITC και 7- αμινοακτινομυκίνη. Ακολούθησε επώαση, μονιμοποίηση και διάτρηση των κυτταρικών μεμβρανών. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία δωματίου και στο σκοτάδι, για 24, 48 και 72 ώρες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μελέτης και την μεθολογία του εργαστηρίου.Τα ηπατοκύτταρα αναγνωρίστηκαν με Hep-Par-1 από την κυτταρομετρία ροής και έγινε χρώση αιματοξυλίνης για την βαφή των πυρήνων. Τελικά παρατηρήθηκαν στο μικροσκόπιο. Με ανοσο-ιστοχημική τεχνική, αναζητήθηκε η έκφραση του CD90 σε τομέςπαραφίνης, δειγμάτων ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Χρησιμοποιήθηκε τοκεκαθαρμένο αντίσωμα CD90 (Thy-1) της affymetrix eBioscience, με αρ. Καταλόγου 14-0909, κλώνος eBio5E10 (5E10), σε συγκέντρωση 0,5 mg/ml καιμε Host/Isotype: mouse IgG1, Kappa, με αναμενόμενη μεμβρανική και κυτταροπλασμική χρώση. Επίσης με την ίδια τεχνική αναζητήθηκε η έκφραση του υποδοχέα Oct3/4 και CXCR4/CD 184.Οι συνεχείς μεταβλητές των ευρημάτων αναφέρονται σαν μέσος όρος μετυπικές αποκλίσεις. Οι συζευγμένες συγκρίσεις μεταξύ ποιοτικών μεταβλητών, έγιναν με την χρήση προσημασμένης δοκιμασίας Wilcoxon. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ H κυτταρική απόδοση υγρού ιστού μετά την κατεργασία με κολλαγενάση ήταν κατά μεγάλη προσέγγιση 7Χ10(6) για τα καρκινικά ηπατοκύτταρα και 5Χ10 (5) για τα υγιή. Αμέσως μετά την απομόνωση η μέση βιωσιμότητα ήταν 90% και 92% αντιστοίχως για τα καρκινικά και υγιή ηπατοκύτταρα. Τα κύτταρα από ΗΚΚ και τα υγιή ηπατοκύτταρα εξέφρασαν την αλβουμίνη σε επίπεδα 94% και 92% αντίστοιχα, όπως τεκμηριώθηκε με την χρήση κυτταρομετρίας ροής.Τα ανοσο-ιστοχημικά αποτελέσματα έδειξαν ότι τα CD90(+) κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ανέδειξαν ογκογόνο (tumorigenic) ικανότητα, που αντίστοιχα δεν ανέδειξαν τα CD90(-) κύτταραΤο υγρό μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού OCT ¾ της Novocastra, με κωδικό ΝCL-L-OCT ¾, κλώνος Ν1ΝΚ, που χρησιμοποιήσαμε, στα αποτελέσματά μας είχαμε 10 περιπτώσεις με πολλά κύτταρα εντόνως θετικά, ενώ σε άλλες 5 περιπτώσεις παρατηρήσαμε ασθενώς θετικά κύτταρα και άλλη 1 με σπανιώτατα μεμονωμένα μετρίως θετικά.Το πολυκλωνικό αντίσωμα CD184/CXCR4 της ThermoFisher SCIENTIFIC,με αρ. Καταλόγου PA3-305, Host/Isotype:Rabbit που χρησιμοποιήσαμε, σε 9 περιπτώσεις μας εκφράσθηκε κυτταροπλασμικά σε πολλά από τα νεοπλασματικά κύτταρα και σε άλλες 6 εκφράσθηκε σε μεμονωμένα νεοπλασματικά κύτταρα. Σε όλες τις θετικές περιπτώσεις παρατηρήθηκε και θετική έκφρασή τουστους διαύλους του Ηering, προφανώς σε δυσδιάκριτα προγονικά/βλαστικάκύτταρα (stem/progenitor cells).Η αποκάλυψη των παραπάνω υποδοχέων στά νεοπλασματικά ηπατοκύτταρα, από ασθενείς με ΗΚΚ, (in vitro), ανιχνεύθησαν κοινοί με υποδοχείς στααρχέγονα καρκινικά ηπατοκύτταρα. Η παρατήρηση αυτή πιθανώς να αποτελέσει σημαντικό στοιχείο στην εξέλιξη της χημειοθεραπείας, με πιό στοχευμένη και εξειδικευμένη δράση, στις περιπτώσεις του ανθεκτικού μέχρι σήμερα ΗΚΚ.

Human thymic epithelial cells maintain long-term survival of clonogenic myeloid and erythroid progenitor cells in vitro

2000 ◽  
Vol 111 (1) ◽  
pp. 363-370 ◽  
Author(s):  
Katsuto Takenaka ◽  
Mine Harada ◽  
Tomoaki Fujisaki ◽  
Koji Nagafuji ◽  
Shinichi Mizuno ◽  
...  
Keyword(s):  
Epithelial Cells ◽  
Progenitor Cells ◽  
Thymic Epithelial Cells ◽  
Erythroid Progenitor ◽  
Term Survival ◽  
Long Term Survival ◽  
Erythroid Progenitor Cells

Gene transfer of endothelial NO-synthase restores migratory capacity of endothelial progenitor cells from patients with coronary artery diseases

2007 ◽  
Vol 30 (4) ◽  
pp. 96
Author(s):  
Michael R. Ward ◽  
Qiuwang Zhang ◽  
Duncan J. Stewart ◽  
Michael J.B. Kutryk
Keyword(s):  
Risk Factors ◽  
Progenitor Cells ◽  
Endothelial Progenitor Cells ◽  
Fold Increase ◽  
No Synthase ◽  
Endothelial Progenitor ◽  
Migratory Capacity ◽  
Acute Mi ◽  
Cad Risk

Autologous endothelial progenitor cells (EPCs) have been used extensively in the development of cell-based therapy for acute MI. However, EPCs isolated from patients with CAD and/or CAD risk factors have reduced regenerative activity compared to cells from healthy subjects. As in endothelial cells, endothelial NO synthase (eNOS) expression and subsequent NO production are believed to be critical determinants of EPC function. Recently, the ability of EPCs to migrate in vitro in response to chemotactic stimuli has been shown to predict their regenerative capacity in clinical studies. Therefore, we hypothesized that the regenerative function of EPCs from patients with or at high risk for CAD will be enhanced by overexpression of eNOS, as assessed by migratory capacity. Methods: EPCs were isolated from the blood of human subjects with CAD risk factors (>15% Framingham risk score; FRS) (± CAD) by Ficoll gradient separation and differential culture. Following 3 days in culture, cells were transduced using lentivirus vectors containing either eNOS or GFP (sham) at an MOI of 3. The cells were cultured for an additional 5 days before being used in functional assays. Cell migration and chemotaxis in response to VEGF (50 ng/mL) and SDF-1 (100 ng/mL) were assessed using a modified Boyden Chamber assay. Results: Transduction at an MOI of 3 led to a ~90-100-fold increase in eNOS mRNA expression and a 5-6 fold increase in eNOS protein expression, as assessed by qRT-PCR and Western Blotting. Moreover, there was a significant improvement in the migration of EPCs following eNOS transduction compared to sham-transduced EPCs in response to both VEGF (44.3 ± 8.4 vs. 31.1 ± 4.6 cells/high power field; n=10, p < 0.05) and SDF-1 (51.9 ± 11.1 vs. 34.5 ± 3.3 cells/HPF; n=10, p < 0.05). Conclusions: These data show that the reduced migration capacity of EPCs isolated from patients with CAD and/or CAD risk factors can be significantly improved through eNOS overexpression in these cells. Thus, eNOS transduction of autologous EPCs may enhance their ability to restore myocardial perfusion and function following acute MI. We intend to further explore the regenerative potential of eNOS-transduced EPCs using various in vitro and in vivo models.

Bone Marrow Niches for Skeletal Progenitor Cells and their Inhabitants in Health and Disease

2019 ◽  
Vol 14 (4) ◽  
pp. 305-319 ◽  
Author(s):  
Marietta Herrmann ◽  
Franz Jakob
Keyword(s):  
Bone Marrow ◽  
Progenitor Cells ◽  
Progenitor Cell ◽  
Adult Stem Cells ◽  
Current Knowledge ◽  
Cell Populations ◽  
Surface Markers ◽  
Bone Marrow Niches

The bone marrow hosts skeletal progenitor cells which have most widely been referred to as Mesenchymal Stem or Stromal Cells (MSCs), a heterogeneous population of adult stem cells possessing the potential for self-renewal and multilineage differentiation. A consensus agreement on minimal criteria has been suggested to define MSCs in vitro, including adhesion to plastic, expression of typical surface markers and the ability to differentiate towards the adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages but they are critically discussed since the differentiation capability of cells could not always be confirmed by stringent assays in vivo. However, these in vitro characteristics have led to the notion that progenitor cell populations, similar to MSCs in bone marrow, reside in various tissues. MSCs are in the focus of numerous (pre)clinical studies on tissue regeneration and repair.Recent advances in terms of genetic animal models enabled a couple of studies targeting skeletal progenitor cells in vivo. Accordingly, different skeletal progenitor cell populations could be identified by the expression of surface markers including nestin and leptin receptor. While there are still issues with the identity of, and the overlap between different cell populations, these studies suggested that specific microenvironments, referred to as niches, host and maintain skeletal progenitor cells in the bone marrow. Dynamic mutual interactions through biological and physical cues between niche constituting cells and niche inhabitants control dormancy, symmetric and asymmetric cell division and lineage commitment. Niche constituting cells, inhabitant cells and their extracellular matrix are subject to influences of aging and disease e.g. via cellular modulators. Protective niches can be hijacked and abused by metastasizing tumor cells, and may even be adapted via mutual education. Here, we summarize the current knowledge on bone marrow skeletal progenitor cell niches in physiology and pathophysiology. We discuss the plasticity and dynamics of bone marrow niches as well as future perspectives of targeting niches for therapeutic strategies.

scholarly journals Immune regulation of in vitro murine megakaryocyte development. Role of T lymphocytes and Ia antigen expression.

1985 ◽  
Vol 162 (6) ◽  
pp. 2053-2067 ◽  
Author(s):  
M W Long ◽  
D N Shapiro
Keyword(s):  
Cell Cycle ◽  
T Cell ◽  
T Lymphocytes ◽  
Progenitor Cells ◽  
Immune Modulation ◽  
Immune Recognition ◽  
Activated T Cells ◽  
Ia Antigen ◽  
Cell Cycle Status

Mitogen-activated murine T lymphocytes or T cell hybridomas produce an activity (megakaryocyte [Mk] potentiator activity) that enhances the in vitro growth and development of Mk colonies. This activity was found in optimal concentrations (2.5%) in T cell hybridoma-conditioned medium, and was also produced by feeder layers of concanavalin A-activated T cells. A subpopulation of murine Mk progenitor cells (colony-forming units; CFU-Mk) bears the Ia antigen. Separate experiments indicated that T cell products stimulate CFU-Mk by increasing their basal levels of Ia expression as well as the frequency of cells actively synthesizing DNA. The hypothesis that the expression of this antigen was related to the cell cycle status of these progenitor cells was confirmed in studies that indicated that ablation of actively cycling cells in vivo abrogated the cytotoxic effects of anti-Ia monoclonal antibodies. The interdependence of T cell lymphokine regulation of both Ia expression and cell cycle status was also seen in in vitro experiments in which Ia+ progenitor cells were eliminated by complement-dependent cytotoxicity. The removal of Ia+ cells prevented 5-hydroxyurea-mediated inhibition of cells in S phase. We hypothesize that immune modulation of megakaryocytopoiesis occurs via soluble T cell products that augment Mk differentiation. Further, the mechanism of immune recognition/modulation may occur via Ia antigens present on the surface of these progenitor cells.

scholarly journals Fetal erythropoiesis in steel mutant mice. III. Defect in differentiation from BFU-E to CFU-E during early development

Blood ◽  
1978 ◽  
Vol 51 (3) ◽  
pp. 539-547 ◽  
Author(s):  
DH Chui ◽  
SK Liao ◽  
K Walker
Keyword(s):  
Progenitor Cells ◽  
Early Development ◽  
The Other ◽  
Mutant Mice ◽  
Erythroid Progenitor ◽  
Erythroid Progenitor Cells ◽  
Other Hand ◽  
Colony Forming Units ◽  
Fetal Erythropoiesis

Abstract Erythroid progenitor cells in +/+ and Sl/Sld fetal livers manifested as burst-forming units-erythroid (BFU-E) and colony-forming units- erythroid (CFU-E) were assayed in vitro during early development. The proportion of BFU-E was higher as mutant than in normal fetal livers. On the other hand, the proportion of CFU-E was less in the mutant than in the normal. These results suggest that the defect in Sl/Sld fetal hepatic erythropoiesis is expressed at the steps of differentiation that effect the transition from BFU-E to CFU-E.

scholarly journals Novel Identified Circular Transcript of RCAN2, circ-RCAN2, Shows Deviated Expression Pattern in Pig Reperfused Infarcted Myocardium and Hypoxic Porcine Cardiac Progenitor Cells In Vitro

2021 ◽  
Vol 22 (3) ◽  
pp. 1390
Author(s):  
Julia Mester-Tonczar ◽  
Patrick Einzinger ◽  
Johannes Winkler ◽  
Nina Kastner ◽  
Andreas Spannbauer ◽  
...  
Keyword(s):  
Myocardial Infarction ◽  
Progenitor Cells ◽  
Regulatory Networks ◽  
Circular Rnas ◽  
Cardiac Progenitor Cells ◽  
Tissue Samples ◽  
Healthy Myocardium ◽  
Acute Mi

Circular RNAs (circRNAs) are crucial in gene regulatory networks and disease development, yet circRNA expression in myocardial infarction (MI) is poorly understood. Here, we harvested myocardium samples from domestic pigs 3 days after closed-chest reperfused MI or sham surgery. Cardiac circRNAs were identified by RNA-sequencing of rRNA-depleted RNA from infarcted and healthy myocardium tissue samples. Bioinformatics analysis was performed using the CIRIfull and KNIFE algorithms, and circRNAs identified with both algorithms were subjected to differential expression (DE) analysis and validation by qPCR. Circ-RCAN2 and circ-C12orf29 expressions were significantly downregulated in infarcted tissue compared to healthy pig heart. Sanger sequencing was performed to identify the backsplice junctions of circular transcripts. Finally, we compared the expressions of circ-C12orf29 and circ-RCAN2 between porcine cardiac progenitor cells (pCPCs) that were incubated in a hypoxia chamber for different time periods versus normoxic pCPCs. Circ-C12orf29 did not show significant DE in vitro, whereas circ-RCAN2 exhibited significant ischemia-time-dependent upregulation in hypoxic pCPCs. Overall, our results revealed novel cardiac circRNAs with DE patterns in pCPCs, and in infarcted and healthy myocardium. Circ-RCAN2 exhibited differential regulation by myocardial infarction in vivo and by hypoxia in vitro. These results will improve our understanding of circRNA regulation during acute MI.

scholarly journals The Radiation-Induced Regenerative Response of Adult Tissue-Specific Stem Cells: Models and Signaling Pathways

Cancers ◽  
2021 ◽  
Vol 13 (4) ◽  
pp. 855
Author(s):  
Paola Serrano Martinez ◽  
Lorena Giuranno ◽  
Marc Vooijs ◽  
Robert P. Coppes
Keyword(s):  
Signaling Pathways ◽  
Progenitor Cells ◽  
Tissue Regeneration ◽  
Normal Tissue ◽  
Cellular Response ◽  
Adult Tissue ◽  
Tissue Specific ◽  
Radiation Induced

Radiotherapy is involved in the treatment of many cancers, but damage induced to the surrounding normal tissue is often inevitable. Evidence suggests that the maintenance of homeostasis and regeneration of the normal tissue is driven by specific adult tissue stem/progenitor cells. These tasks involve the input from several signaling pathways. Irradiation also targets these stem/progenitor cells, triggering a cellular response aimed at achieving tissue regeneration. Here we discuss the currently used in vitro and in vivo models and the involved specific tissue stem/progenitor cell signaling pathways to study the response to irradiation. The combination of the use of complex in vitro models that offer high in vivo resemblance and lineage tracing models, which address organ complexity constitute potential tools for the study of the stem/progenitor cellular response post-irradiation. The Notch, Wnt, Hippo, Hedgehog, and autophagy signaling pathways have been found as crucial for driving stem/progenitor radiation-induced tissue regeneration. We review how these signaling pathways drive the response of solid tissue-specific stem/progenitor cells to radiotherapy and the used models to address this.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document