scholarly journals Human amniotic stem cells-derived exosmal miR-181a-5p and miR-199a inhibit melanogenesis and promote melanosome degradation in skin hyperpigmentation, respectively

2021 ◽  
Vol 12 (1) ◽  
Author(s):  
Xiao-Yu Wang ◽  
Xiao-Hui Guan ◽  
Zhen-Ping Yu ◽  
Jie Wu ◽  
Qi-Ming Huang ◽  
...  
Keyword(s):  
Stem Cells ◽  
Western Blot ◽  
Melanin Synthesis ◽  
Skin Substitutes ◽  
Rt Pcr ◽  
B16f10 Cells ◽  
Skin Hyperpigmentation ◽  
Underlying Mechanisms

Abstract Background Hyperpigmentation of skin is caused by an imbalance between the melanosome/melanin synthesis in melanocytes and the melanosome/melanin degradation in keratinocytes. Although studies showed that stem cells play a role in hypopigmentation, the underlying mechanisms are far not elucidated. Human amniotic stem cells (hASCs) including human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) and human amniotic epithelial stem cells (hAESCs) were considered to be a promising cell source for stem cells-based therapy of many diseases clinically due to their pluripotent potential, no tumorigenesis and immunogenicity, no ethical issues, and potent paracrine effects. Here, we reported that both hASCs and their conditional medium (CM) had a potent anti-hyperpigmentation in skin in vivo and in vitro. Methods hAESCs and hAMSCs were identified by RT-PCR, flow cytometric analysis and immunofluorescence. Effects of hASCs and hASC-CM on pigmentation were evaluated in B16F10 cells stimulated with α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH), and mouse ears or human skin substitutes treated with ultraviolet radiation B (UVB). Expressions of the key proteins related with melanogenesis and autophagic flux were detected by western blot in B16F10 cells for further exploring the effects and the underlying mechanisms of hAESC-CM and hAMSC-CM on melanogenesis and melanosome degradation. The hAMSCs exosomes-derived miRNAs were determined by sequencing. RT-PCR, western blot, melanin content analysis and luciferase activity assay were used to determine the hypopigmentation of miR-181a-5p and miR-199a. Results In our study, we observed that both hASCs and their CM significantly alleviated the α-MSH in B16F10 cells or UVB-induced hyperpigmentation in mouse ears or human skin substitutes by suppressing melanin synthesis and promoting melanosome degradation in vivo and in vitro. Furthermore, we demonstrated that miR-181a-5p and miR-199a derived from hASCs exosomes remarkably inhibited melanogenesis by suppressing MITF (microphthalmia-associated transcription factor) which is a master regulator for governing melanogenesis and promoting melanosome degradation through activating autophagy, respectively. Conclusions Our studies provided strong evidence that the conditional medium and exosomes derived from hAMSCs inhibit skin hyperpigmentation by suppressing melanogenesis and promoting melanosome degradation, indicating that the hASCs exosomes or their released microRNAs might be as reagents for cell-free therapy in hyperpigmented disorders clinically.

scholarly journals Bone marrow mesenchymal stem cells promote prostate cancer cell stemness via cell–cell contact to activate the Jagged1/Notch1 pathway

2021 ◽  
Vol 11 (1) ◽  
Author(s):  
Ji-wen Cheng ◽  
Li-xia Duan ◽  
Yang Yu ◽  
Pu Wang ◽  
Jia-le Feng ◽  
...  
Keyword(s):  
Prostate Cancer ◽  
Stem Cells ◽  
Mesenchymal Stem Cells ◽  
Western Blot ◽  
Cell Contact ◽  
Activity Levels ◽  
Tumor Resistance ◽  
Cell Cell

Abstract Background Mesenchymal stem cells (MSCs) play a crucial role in cancer development and tumor resistance to therapy in prostate cancer, but the influence of MSCs on the stemness potential of PCa cells by cell–cell contact remains unclear. In this study, we investigated the effect of direct contact of PCa cells with MSCs on the stemness of PCa and its mechanisms. Methods First, the flow cytometry, colony formation, and sphere formation were performed to determine the stemness of PCaMSCs, and the expression of stemness-related molecules (Sox2, Oct4, and Nanog) was investigated by western blot analysis. Then, we used western blot and qPCR to determine the activity levels of two candidate pathways and their downstream stemness-associated pathway. Finally, we verified the role of the significantly changed pathway by assessing the key factors in this pathway via in vitro and in vivo experiments. Results We established that MSCs promoted the stemness of PCa cells by cell–cell contact. We here established that the enhanced stemness of PCaMSCs was independent of the CCL5/CCR5 pathway. We also found that PCaMSCs up-regulated the expression of Notch signaling-related genes, and inhibition of Jagged1-Notch1 signaling in PCaMSCs cells significantly inhibited MSCs-induced stemness and tumorigenesis in vitro and in vivo. Conclusions Our results reveal a novel interaction between MSCs and PCa cells in promoting tumorigenesis through activation of the Jagged1/Notch1 pathway, providing a new therapeutic target for the treatment of PCa.

Δημιουργία, in vitro πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση ανθρώπινων επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων

2016 ◽  
Author(s):  
Ιωάννα Βαρελά
Keyword(s):  
Stem Cells ◽  
Induced Pluripotent Stem Cells ◽  
Mesenchymal Stromal Cells ◽  
Stromal Cells ◽  
Pluripotent Stem Cells ◽  
Rt Pcr ◽  
Induced Pluripotent

Η ανακάλυψη της μεθόδου του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (induced pluripotent stem cells, iPSCs) το 2007 άνοιξε το δρόμο για τη μελέτη και την εξατομικευμένη θεραπεία πολλών χρόνιων νόσων. Επιδιώξαμε να δημιουργήσουμε iPS - κυτταρικές σειρές επαναπρογραμματίζοντας μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (mesenchymal stromal cells, MSCs) μυελού των οστών, μέσω μιας μεθόδου επαναπρογραμματισμού χωρίς ενσωμάτωση γονιδίων στο γενετικό υλικό των κυττάρων. Δερματικοί ινοβλάστες από φυσιολογικούς δότες και μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα μυελού των οστών από φυσιολογικό δότη μεταμόσχευσης μυελού των οστών και από ασθενή με β-Μεσογειακή αναιμία (β-ΜΑ) διαμολύνθηκαν, μέσω λιποσωματικών φορέων, με συνθετικά mRNA που κωδικοποιούν τους μεταγραφικούς παράγοντες Oct4, Klf4, Sox2, Lin28, c-Myc. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ελέγχθηκαν σε καλλιέργειες για τον σχηματισμό αποικιών πολυδύναμων βλαστοκυττάρων. Οι αποικίες απομονώθηκαν και με συνεχείς ανακαλλιέργειες δημιουργήθηκαν κυτταρικές σειρές, οι οποίες εξετάστηκαν για την πολυδυναμία τους με μεθόδους ανίχνευσης της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων πολυδυναμίας (κυτταρομετρία ροής, RT-PCR, μελέτη του μεταγραφώματος με RNA μικροσυστοιχίες). Ως θετικός μάρτυρας και μέτρο σύγκρισης χρησιμοποιήθηκε πολύ καλά χαρακτηρισμένη εμβρυονική σειρά πολυδύναμων βλαστοκυττάρων. Οι iPS-κυτταρικές σειρές μελετήθηκαν, επίσης, ως προς τη λειτουργική τους πολυδυναμία με τον έλεγχο της ικανότητας τους να δημιουργούν in vitro εμβρυϊκά σωματίδια και in vivo τερατώματα μετά από υποδόρια εμφύτευση τους σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς, και ως προς τη δυνατότητα διαφοροποίησής τους σε αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα. Η γενετική σταθερότητα των κυτταρικών σειρών ελέγχθηκε με DNA μικροσυστοιχίες συγκριτικού γονιδιωματικού υβριδισμού (aCGH). Απομονώθηκαν 3 iPS κυτταρικές σειρές από κάθε δείγμα κυττάρων, οι οποίες εμφανίζουν μεταγράφωμα πανομοιότυπο με εκείνο των πολυδύναμων εμβρυονικών βλαστοκυττάρων και. δημιουργούν εμβρυϊκά σωματίδια in vitro και τερατώματα in vivo, τα οποία αποτελούνται από ιστούς καταγωγής και από τα τρία βλαστικά δέρματα. Τα iPSCs των κυτταρικών σειρών πολλαπλασιάζονται για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς μορφολογικές ενδείξες διαφοροποίησης. Με τη μέθοδο aCGH, στις iPS κυτταρικές σειρές μετά την 10η ανακαλλιέργεια ανιχνεύθηκαν πολυμορφισμοί στον αριθμό αντιγράφων (CNVs), τα οποία ήταν ελλείμματα μεγέθους περίπου 3 Mb. Η διαφοροποίηση των iPSCs σε αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα οδήγησε στην παραγωγή CD34+ κυττάρων σε ποσοστό 8-10% των παραχθέντων κυττάρων με ασθενούς έντασης συνέκφραση του CD45, προσομοιάζοντας στο αιμαγγειακό στελεχιαίο κύτταρο. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται, για πρώτη φορά στην Ελλάδα, εξ όσων γνωρίζουμε, η τεχνολογία παραγωγής ανθρώπινων iPSCs με μια ασφαλή και αξιόπιστη μέθοδο. Οι iPSCs-κυτταρικές σειρές μπορεί να χρησιμοποιηθούν στη μελέτη ασθενειών, στον έλεγχο φαρμάκων και στην ανάπτυξη πρωτοκόλλων ιστικής μηχανικής και κυτταρικής θεραπείας.

scholarly journals Rosiglitazone Ameliorates Spinal Cord Injury via Inhibiting Mitophagy and Inflammation of Neural Stem Cells

2022 ◽  
Vol 2022 ◽  
pp. 1-22
Author(s):  
Qingqi Meng ◽  
Zhiteng Chen ◽  
Qingyuan Gao ◽  
Liqiong Hu ◽  
Qilong Li ◽  
...  
Keyword(s):  
Spinal Cord ◽  
Stem Cells ◽  
Spinal Cord Injury ◽  
Neural Stem Cells ◽  
Atp Production ◽  
Beneficial Effects ◽  
Cord Injury ◽  
Underlying Mechanisms

Background. Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease, and traumatic brain and spinal cord injury (SCI) are prevalent in clinical practice. Inhibition of hyperactive inflammation and proliferation of endogenous neural stem cells (NSCs) is a promising treatment strategy for SCI. Our previous studies demonstrated the beneficial effects of rosiglitazone (Rosi) on SCI, but its roles in inflammation inhibition and proliferation of NSCs are unknown. Methods. SCI in a rat model was established, and the effects of Rosi on motor functions were assessed. The effects of Rosi on NSC proliferation and the underlying mechanisms were explored in details. Results. We showed that Rosi ameliorated impairment of moto functions in SCI rats, inhibited inflammation, and promoted proliferation of NSCs in vivo. Rosi increased ATP production through enhancing glycolysis but not oxidative phosphorylation. Rosi reduced mitophagy by downregulating PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) transcription to promote NSC proliferation, which was effectively reversed by an overexpression of PINK1 in vitro. Through KEGG analysis and experimental validations, we discovered that Rosi reduced the expression of forkhead box protein O1 (FOXO1) which was a critical transcription factor of PINK1. Three FOXO1 consensus sequences (FCSs) were found in the first intron of the PINK1 gene, which could be potentially binding to FOXO1. The proximal FCS (chr 5: 156680169–156680185) from the translation start site exerted a more significant influence on PINK1 transcription than the other two FCSs. The overexpression of FOXO1 entirely relieved the inhibition of PINK1 transcription in the presence of Rosi. Conclusions. Besides inflammation inhibition, Rosi suppressed mitophagy by reducing FOXO1 to decrease the transcription of PINK1, which played a pivotal role in accelerating the NSC proliferation.

scholarly journals Oroxin B Induces Apoptosis by Down-Regulating MicroRNA-221 Resulting in the Inactivation of the PTEN/PI3K/AKT Pathway in Liver Cancer

Molecules ◽  
2019 ◽  
Vol 24 (23) ◽  
pp. 4384 ◽  
Author(s):  
Nannan Li ◽  
Wenxiao Men ◽  
Yibo Zheng ◽  
Hechen Wang ◽  
Xiansheng Meng
Keyword(s):  
Liver Cancer ◽  
Western Blot ◽  
Microfluidic Chip ◽  
Pten Gene ◽  
Control Group ◽  
Rt Pcr ◽  
Mrna And Protein Expression ◽  
Theoretical Evidence

This study aims to investigate the anticancer effect of Oroxin B (OB) both in vitro and in vivo, and the molecular mechanism involved in microRNA-221 and the PI3K/Akt/PTEN pathway through modulation of apoptosis in Hepatocellular carcinoma (HCC). DEN-induced rats and HepG2 cells based on the microfluidic chip were employed, while the mRNA and protein expression of microRNA-221, PI3K, p-Akt and PTEN were evaluated by RT-PCR and Western blot analysis. Based on Microfluidic Chip and DENinduced rat model, OB effectively exerts anti-liver cancer effect both in vitro and in vivo, and the expression of miR-221 in OB treated groups was significantly lower than that in the control group (** p < 0.01). The RT-PCR and Western blot results suggested the PI3K mRNA and protein in OB treated groups were both lower than those in control group and indicated the overexpression of PTEN. Therefore, OB effectively exerts anticancer effects by positively regulating the PTEN gene and then inactivating the PI3K/Akt signaling pathway through down-regulating the expression of the microRNA-221, thereby inducing apoptosis of liver cancer cells. This study offers a theoretical evidence for further development and clinical guidance of OB as an anti-tumor agent.

scholarly journals Photodynamic Therapy Enhanced the Antitumor Effects of Berberine on HeLa Cells

2019 ◽  
Vol 17 (1) ◽  
pp. 413-421 ◽  
Author(s):  
Han-Qing Liu ◽  
Ya-Wen An ◽  
A-Zhen Hu ◽  
Ming-Hua Li ◽  
Guang-Hui Cui
Keyword(s):  
Photodynamic Therapy ◽  
Western Blot ◽  
Hela Cells ◽  
Mammalian Target Of Rapamycin ◽  
Control Group ◽  
Antitumor Effects ◽  
Underlying Mechanisms ◽  
And Control

AbstractIn this study we investigated the antineoplastic effects of Berberine (BBR)-mediated photodynamic therapy (PDT) on HeLa cells and its related mechanisms. The CCK-8 assay and flow cytometry were used to evaluate the proliferation and apoptosis of cells respectively. In addition, changes in protein expression levels were assessed using western blot. BBR at dose of 10 mg/kg was injected intraperitoneally to mice with tumors and PDT treatments were performed 24 hours later. In vivo imaging systems were used to evaluate the fluorescence of BBR. In vitro, PDT significantly enhanced the effects of BBR on inducing cell apoptosis and inhibiting proliferation. The in vivo results showed that the fluorescence intensity in the PDT group was decreased compared with that in the BBR group. Tumor weights and tumor size in the PDT group were less than those in the control group; however, when BBR was applied without PDT, no significant differences were observed between the BBR and control group. The results of western blot showed that PDT enhanced the inhibitory effects of BBR on the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway, that may partly explain the potential underlying mechanisms.

337 PROMOTER-DEPENDENT SILENCING OF REPROGRAMMING TRANSCRIPTION FACTORS IN MOUSE INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS PRODUCED WITH SLEEPING BEAUTY TRANSPOSON VECTORS

2015 ◽  
Vol 27 (1) ◽  
pp. 257
Author(s):  
S. G. Petkov ◽  
W. A. Kues ◽  
H. Niemann
Keyword(s):  
Stem Cells ◽  
Transcription Factors ◽  
Induced Pluripotent Stem Cells ◽  
Pluripotent Stem Cells ◽  
Sleeping Beauty ◽  
Rt Pcr ◽  
Induced Pluripotent ◽  
Pluripotency Genes

Epigenetic silencing of the transgenes has been considered a prerequisite for complete reprogramming of mouse somatic cells to induced pluripotent stem cells (miPSC). Here, we examined the activity status of the reprogramming transcription factors in miPSC produced with Sleeping Beauty (SB) transposon vectors carrying expression cassettes with the porcine OCT4, SOX2, c-MYC, and KLF4 (pOSMK) under the control of doxycycline (DOX)-inducible (TetO) or constitutive (CAG) promoters. Mouse embryo fibroblasts (MEF) were electroporated with SB-TetO-rTA-SV40pA-TetO-pOSMK-IRES-tdTomato-bGHpA (TetO group) or with SB-loxP-CAG-pOSMK-IRES-tdTomato-SV40pA-loxP (CAG group) together with SB100x (SB transposase). The cells were cultured on mitotically inactivated MEF feeders with DMEM supplemented with 20% knockout serum replacement, 2 mM l-glutamine, penicillin-streptomycin, nonessential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1000 U mL–1 of ESGRO, and 5 µg mL–1 of DOX. The miPSC colonies were individually picked, disaggregated to single cells, and propagated further under the same culture conditions. Three cell lines from each experimental group were examined for pluripotency characteristics, and the activity of the transgenes was monitored by the presence of tdTomato fluorescence and by RT-PCR. The miPSC produced with TetO vector silenced the transgene expression within 11 days post-transfection (in the presence of DOX) and upregulated the endogenous pluripotency genes Oct4, Sox2, Nanog, Rex1, and Utf1. These cells showed typical miPSC morphology and ability to differentiate into cells from the 3 primary germ layers in vitro and in vivo (teratomas). At the same time, the miPSC from the CAG group did not silence the transgenes even after 20 passages of continuous propagation, although they upregulated the endogenous pluripotency genes similarly to the TetO group. Moreover, these cells also showed ability to differentiate in vitro into cells from the 3 germ layers (contracting cardiac myocytes, neurons, epithelia) expressing differentiation markers Afp, Sox17, Gata4, Gata6, cardiac troponin, nestin, and PGP 9.5. Following Cre-mediated excision of the reprogramming cassette, the miPSC from the CAG group continued to self-renew and the expression of pluripotency markers Oct4, Sox2, Nanog, and Rex1 did not change significantly, as evidenced by real-time RT PCR (all P > 0.1), showing that these cells were not dependent on the transgenes for maintaining their pluripotency characteristics. Currently, we are investigating the ability of the miPSC from the CAG group to differentiate in vivo by producing teratomas and chimeras. The results from our preliminary investigations suggest that porcine transcription factors can be used for production of miPSC and that the silencing of the reprogramming transcription factors in miPSC is promoter-dependent, but may not be absolutely necessary for complete reprogramming to pluripotency.

In Vitro and In Vivo Mesenchymal Stem Cells Neurotrophin Production but Limited Neuronal Differentiation.

Blood ◽  
2005 ◽  
Vol 106 (11) ◽  
pp. 1687-1687
Author(s):  
Patrizia Bossolasco ◽  
Davide Soligo ◽  
Yvan Torrente ◽  
Federica Pisati ◽  
Mirella Meregalli ◽  
...  
Keyword(s):  
Stem Cells ◽  
Neural Differentiation ◽  
Human Mscs ◽  
Post Injection ◽  
Rt Pcr ◽  
Differentiation Potential ◽  
Fluorescent Cells ◽  
The Brain

Abstract The aim of the present work was to explore mesenchymal stem cells (MSCs) differentiation potential towards neural phenotype. MSCs are self-renewable multipotent cells shown to be able to support hematopoiesis and to improve functional outcomes in animal models of neurological disorders. MSCs were obtained by plastic adherence from iliac crest bone marrow of healthy donors for allogeneic transplantation and, for the in vitro studies, were cultured on laminin-coated dishes in a B27 Neurobasal medium with 3% to 10% FBS for 3 weeks. Few cell (11%) showing bipolar morphologies, expressed β-tubulin III and GFAP. Furthermore, only GAP43 expression was detected by RT-PCR. Addition of exogenous neurotrophins to cultures did not improve neural differentiation. To investigate the brain microenvironment effect on MSCs, cells were cultured on brain sections and supernatant of the cultures analyzed by ELISA. In this condition, MSCs were shown to release soluble human NT3/NT4 and NGF and to express p75 and TrkC receptors by immunocytochemistry. In order to improve these observations, we analyzed the human neurotrophin and receptor gene expression profile by GEArray technology. The expression patterns of human trkC, NT3, NT4, and NGF mRNA were consistent with the results of immunostaining. To evaluate the in vivo MSCs differentiation potential, 50.000 cells labeled with a fluorescent dye (PKH26) were injected into the right parietal cortex of newborn Balb/C and nude mice (4 and 7 days old). Seven and 45 days later, immunocytochemistry and RT-PCR were performed on brain sections using the following neural specific markers: neurofilament-M, NSE, GFAP, b-tubulin III, MAP-2ab, nestin, Gal-C, and anti TrkC, TrkA and p75NFGR. FISH analysis was also performed using both Cy-3 labeled human Pan Centromeric and FITC labeled mouse Pan Centromeric probes. In 7 out of 52 Balb/C mice analyzed, fluorescent cells were detected 30 days post-injection but only one mouse showed NF and MAP-2ab expression by immunocytochemistry on FISH positive cells thirty days after transplantation. These data were confirmed by RT-PCR for the presence of human GAPDH. In nude mice, fluorescent cells were also detected away from the site of injection indicating cells migration throughout the brain. Moreover, 7 and 45 days post-injection, a high percentage of cells was shown to express the TrkC and p75 receptors. Isolation of the single human MSCs transplanted cells from brain sections was performed by laser microdissection analysis. ELISA analysis from these dissected areas showed the expression of human NT3/NT4 and NGF neurotrophin’s. Finally, several transplanted human MSCs expressing the Ve-cadherin were found close to blood vessels after 45 days of transplantation, whereas these cells were negative for human KDR and CD45. In addition, we determined the capability of conditioned MSCs media to regulate the angiogenesis in a tube formation assay. In conclusion, our data show an in vitro and in vivo capacity of MSCs to express neurotrophins under epigenetic stimuli rather than a real neural differentiation potential.

scholarly journals Mesenchymal Stem Cells Attenuate Radiation-Induced Brain Injury by Inhibiting Microglia Pyroptosis

2017 ◽  
Vol 2017 ◽  
pp. 1-11 ◽  
Author(s):  
Huan Liao ◽  
Hongxuan Wang ◽  
Xiaoming Rong ◽  
Enqin Li ◽  
Ren-He Xu ◽  
...  
Keyword(s):  
Stem Cells ◽  
Mesenchymal Stem Cells ◽  
Brain Injury ◽  
Inflammasome Activation ◽  
Rt Pcr ◽  
Caspase 1 ◽  
Radiation Induced ◽  
The Impact

Radiation-induced brain injury (RI) commonly occurs in patients who received head and neck radiotherapy. However, the mechanism of RI remains unclear. We aimed to evaluate whether pyroptosis was involved in RI and the impact of mesenchymal stem cells (MSCs) on it. BALB/c male mice (6–8 weeks) were cranially irradiated (15 Gy), and MSCs were transplanted into the bilateral cortex 2 days later; then mice were sacrificed 1 month later. Meanwhile, irradiated BV-2 microglia cells (10 Gy) were cocultured with MSCs for 24 hours. We observed that irradiated mice brains presented NLRP3 and caspase-1 activation. RT-PCR then indicated that it mainly occurred in microglia cells but not in neurons. Further, irradiated BV-2 cells showed pyroptosis and increased production of IL-18 and IL-1β. RT-PCR also demonstrated an increased expression of several inflammasome genes in irradiated BV-2 cells, including NLRP3 and AIM2. Particularly, NLRP3 was activated. Knockdown of NLRP3 resulted in decreased LDH release. Noteworthily, in vivo, MSCs transplantation alleviated radiation-induced NLRP3 and caspase-1 activation. Moreover, in vitro, MSCs could decrease caspase-1 dependent pyroptosis, NLRP3 inflammasome activation, and ROS production induced by radiation. Thus, our findings proved that microglia pyroptosis occurred in RI. MSCs may act as a potent therapeutic tool in attenuating pyroptosis.

scholarly journals Macrophage-derived Apoptotic Vesicles Regulate Fate Commitment of Mesenchymal Stem Cells via miR155

2021 ◽  
Author(s):  
Yuan Zhu ◽  
Xiao Zhang ◽  
Kunkun Yang ◽  
Yuzi Shao ◽  
Ranli Gu ◽  
...  
Keyword(s):  
Tissue Engineering ◽  
Stem Cells ◽  
Mesenchymal Stem Cells ◽  
Western Blot ◽  
Molecular Mechanisms ◽  
Proliferation Ability ◽  
Immunomodulatory Function

Abstract Background In tissue engineering, mesenchymal stem cells (MSCs) are common seed cells because of abundant sources, strong proliferation ability and immunomodulatory function. Numerous researches have demonstrated that MSC-macrophage crosstalk played a key role in the tissue engineering. Macrophages could regulate the differentiation of MSCs via different molecular mechanisms, including extracellular vesicles. Apoptotic macrophages could generate large amounts of apoptotic vesicles (apoVs), whereas the functions of macrophage-derived apoVs remain largely unknown. There was no research to clarify the role of macrophage-derived apoVs in MSC fate choices. In this study, we aimed to characterize macrophage-derived apoVs, and investigate the roles of macrophage-derived apoVs in the fate commitment of MSCs. Methods We characterized macrophage-derived apoVs, and investigated their role in MSC osteogenesis and adipogenesis in vitro and in vivo. Furthermore, we performed microRNA loss- and gain- of function experiments and western blot to determine the molecular mechanism. Results We found that macrophage-derived apoVs inhibited osteogenesis and promoted adipogenesis in vitro and in vivo. In mechanism, apoVs regulated osteogenesis and adipogenesis of MSCs by delivering microRNA155 (miR155). Conclusions Macrophage-derived apoVs could regulate the osteogenesis and adipogenesis of MSCs through delivering miR155, which provided novel insights for MSC-mediated tissue engineering.

scholarly journals Μελέτη του ρόλου των συστατικών του μεταβολικού μονοπατιού της HDL στην παθογένεια της οστεοπόρωσης και της οστεοαρθρίτιδας

2017 ◽  
Author(s):  
Ελένη Καλυβιώτη
Keyword(s):  
Western Blot ◽  
High Density Lipoprotein ◽  
Real Time ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Rt Pcr ◽  
Knock Out

Εισαγωγή: Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι διαταραχές στον λιπιδικό μεταβολισμό επηρεάζουν τη λειτουργία των κυττάρων του οστού με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση (ΟΠ). Η ΟΠ αποτελεί μια κοινή μεταβολική διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από μειωμένη οστική μάζα και σταδιακή επιδείνωση της μικροαρχιτεκτονικής δομής του οστίτη ιστού. Επακολούθως, οι ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων. Τα τελευταία χρόνια αρκετές μελέτες ανέδειξαν την ύπαρξη μιας ισχυρής σύνδεσης μεταξύ του οστικού και λιπιδικού μεταβολισμού. Επιπλέον, τόσο η ομάδα μας όσο και άλλοι ερευνητές έχουν δείξει ότι διαταραχές στο μεταβολισμό της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (High Density Lipoprotein-HDL) ενέχονται στην εμφάνιση μεταβολικών νοσημάτων, όπως είναι η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο της HDL στον μεταβολισμό των λιπιδίων στο πλάσμα και στους ιστούς και οδηγούμενοι από τα ευρήματα της δικής μας ομάδας αλλά και άλλων ερευνητών, στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε το ρόλο της απολιποπρωτεΐνης Α1 (APOA1), βασικού συστατικού του μονοπατιού βιοσύνθεσης της HDL, στη ρύθμιση της λειτουργίας των κυττάρων του οστού και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικών.Μεθοδολογία: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της ApoA1 (ApoΑ1-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου). Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Πριν την ευθανασία λήφθηκε πλάσμα αίματος και ακολούθως τα ζώα θυσιάστηκαν. Από τα πειραματόζωα απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογικές, ιστομορφομετρικές, εμβιομηχανικές και in vitro αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού (στατική ιστομορφομετρία). Με τη χρώση TRAP και τη χρώση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών, ενώ αναλύθηκαν και οι εμβιομηχανικές ιδιότητες του οστού (αντοχή σε θραύση, ελαστικότητα κλπ) με τη χρήση του 3-point bending, στις δύο ομάδες πειραματόζωων. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα (MSC) του μυελού των οστών απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση της έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική (RUNX2, OSX, COL1A1) και στην οστεοκλαστική λειτουργία (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ) καθώς και στην λιπογένεση (PPARγ, CEBPA). Επίσης, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολικό μονοπάτι της χοληστερόλης (ApoA2, Ggps, Hmgcr, Hdlbp, Fdps1, Cpt1a, Scarb1), αλλά και των γονιδίων που σχετίζονται με τη διατήρηση και την κινητοποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων (Ptprc, Sca-1, Cxcl12, Cxcr4, Anxa2). Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη real time RT-PCR. Αποτελέσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της οστικής μάζας στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα ποντίκια αγρίου τύπου. Η έκφρασης της ACTH ήταν όμοια και στις δυο ομάδες ζώων, ενώ τα επίπεδα mRNA του Scarb1 ήταν σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Τα αποτελέσματα της στατικής και δυναμικής ιστομορφομετρίας έδειξαν ότι η μειωμένη οστική μάζα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια αντικατοπτρίζει τη μειωμένη οστική σύνθεση. Η ανάλυση της βιοχημικής σύνθεσης και των εμβιομηχανικών ιδιοτήτων των μηριαίων οστών, έδειξε ότι αυτές οι παράμετροι ήταν διαταραγμένες στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα αγρίου τύπου ποντίκια. Επιπρόσθετα, η επαγωγή διαφοροποίησης των MSC, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, από τα ΑpoΑ1-/- ποντίκια φαίνεται να εμφανίζει μειωμένη παραγωγή οστεοβλαστών και αυξημένη παραγωγή λιποβλαστών σε αντίθεση με τα MSC από αγρίου τύπου ποντίκια. Αυτό φανερώνει την ύπαρξη μιας μετατόπισης στην ισορροπία της διαδικασίας διαφοροποίησης των MSC, η οποία ευνοεί την λιπογένεση. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συμφωνία με την αρχική ιστολογική παρατήρηση της ύπαρξης αυξημένων λιποκυττάρων στο μυελό των οστών των ΑpoΑ1-/- ποντικιών σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου. Αντίθετα με τα ευρήματα για τη δυσλειτουργία των οστεοβλαστών, η οστεοκλαστική διαφοροποίηση in vitro και η μέτρηση της οστεοκλαστικής επιφάνειας in vivo εμφανίζονται ανεπηρέαστες. Επιπρόσθετα, σε ολικά κύτταρα του μυελού των οστών, σε συμφωνία με τα αυξημένα λιποκύτταρα και τα δεσμευμένα προς λιποβλάστες αρχέγονα MSC, τα επίπεδα έκφρασης του PPARγ είναι στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Ακόμα, στο μυελό των οστών στα apoΑ1-/- ποντίκια η έκφραση της κυτταροκίνης CXCL12 είναι μειωμένη, ενώ του CXCR4 αυξημένη, στοιχεία που συμφωνούν με μειωμένη σηματοδότηση στο μονοπάτι που εμπλέκεται στη διατήρηση των MSC (homing) και την οστεοβλαστική διαφοροποίηση. Επιπλέον, στα ApoΑ1-/- ποντίκια παρατηρείται σημαντική μείωση στους παράγοντες που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και λειτουργία των οστεοβλαστών, όπως είναι ο RUNX2, ο OSX και ο COL1A1. Ενώ, επίσης τα knock out ποντίκια εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του παράγοντα CEPBa, υποδηλώνοντας την ύπαρξη πολύπλοκων αλλαγών στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση που απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.Συμπεράσματα: Η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε ελάττωση της οστικής μάζας, κυρίως λόγω μειωμένης λειτουργίας των οστεοβλαστών. Επιπλέον, η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε αύξηση της λιπογένεσης και μείωση της οστεοβλαστογένεσης, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε ελαττωματική σύνθεση οστού, ενώ παράλληλα η δράση των οστεοκλαστών παραμένει ανεπηρέαστη. Τα αποτελέσματα μας, για πρώτη φορά, αναδεικνύουν ότι η APOA1 ρυθμίζει τη λειτουργία των οστεοβλαστών και των λιποβλαστών και αυξάνει την πιθανότητα ότι η APOA1 μπορεί να δράσει ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης και άλλων μεταβολικών νοσημάτων.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document