The Hyaluronan-Related Genes HAS2, HYAL1-5, HYALP1 are Associated with Prognosis, Cell Viability and Spheroid Formation Capacity in Ovarian Cancer

Purpose: Hyaluronan modulates tumor progression, including cell adhesion, cohesion, proliferation and invasion, and the cancer stem cell phenotype. In ovarian cancer, high levels of stromal hyaluronan are associated with poor prognosis. In this work hyaluronan synthases (HAS1-3) and hyaluronidases (HYAL1-5, HYALP1) were examined with regard to different levels of gene expression and its influence on ovarian cancer patients survival. The impact of a siRNA depletion of hyaluronic acid synthase HAS2 was investigated in vitro.Methods: Using the Kaplan Meier Plotter tool, we investigated the influence of hyaluronic synthesis enzymes on the survival of a collective of 1435 ovarian cancer patients. We studied SKOV3 ovarian cancer cells subjected to HAS2 siRNA or control siRNA treatment in terms of HAS1-3, HYAL2 and HYAL3 mRNA expression. We investigated the ability to form spheroids using the Hanging Drop method and the response to chemotherapy at different concentrations using the MTT Assay. By String analysis, interactions within the enzymes of the hyaluronic acid system and with binding partners were visualized. Results: HAS2 improves cell viability, the capability to form tumor spheroids and has a negative prognostic value regarding overall survival. Lower HAS2 expression and high expression of HYAL2 and HYAL3 favours the survival of ovarian cancer patients. HAS2 knockdown cells and control cells showed a moderate response to in vitro chemotherapy with Taxol, Cisplatin and combinatorial treatment. Conclusion: In conclusion our study shows that the hyaluronic acid system has a relevant influence on the survival of ovarian cancer patients and could therefore be considered as a possible prognostic factor.

Equine Endometrosis Pathological Features: Are They Dependent on NF-κB Signaling Pathway?

Endometrosis is an important mares’ disease which considerably decreases their fertility. As classic endometrial classification methods might be insufficient for tissue pathological evaluation, further categorization into active/inactive and destructive/non-destructive types was developed by Hoffmann and others. This study aimed to compare NF-κB pathway genes transcription among histopathological types of endometrosis, following Hoffmann and co-authors’ classification. Endometrial samples, collected postmortem from cyclic mares (n = 100) in estrus or diestrus, were classified histologically and used for gene transcription assessment. Gene transcription of NF-κB subunits (RelA, NF-κB1, NF-κB2), pro-inflammatory molecules (MCP-1, IL-6), and hyaluronan synthases (HAS 1, HAS 2, HAS 3) was compared among endometrosis types (active, non-active, destructive, non-destructive). Most individual mRNA samples showed high expression of RelA, NF-κB1, and MCP-1 gene transcripts and the destructive type of endometrosis, simultaneously. The expression of RelA and NF-κB1 genes was higher in active destructive group than in the other groups only in the follicular phase, as well as being higher in the inactive destructive group than in the others, only in the mid-luteal phase. The increase in gene transcription of the NF-κB canonical activation pathway in destructive endometrosis may suggest the highest changes in extracellular matrix deposition. Moreover, the estrous cycle phase might influence fibrosis pathogenesis.

Panax ginseng C. A. Meyer Phenolic Acid Extract Alleviates Ultraviolet B-Irradiation-Induced Photoaging in a Hairless Mouse Skin Photodamage Model

Here, we evaluated the in vivo skin-protective effects of topical applications of Panax ginseng C. A. Meyer extract (PG2) and its phenolic acid- (PA-) based components against UVB-induced skin photoaging. PG2 or PA applied to skin of hairless mice after UVB-irradiation alleviated UVB-induced effects observed in untreated skin, such as increased transepidermal water loss (TEWL), increased epidermal thickness, and decreased stratum corneum water content without affecting body weight. Moreover, PG2 and PA treatments countered reduced mRNA-level expression of genes encoding filaggrin (FLG), transglutaminase-1 (TGM1), and hyaluronan synthases (HAS1, HAS2, and HAS3) caused by UVB exposure and reduced UVB-induced collagen fiber degradation by inhibiting the expression of matrix metalloproteinase genes encoding MMP-1, MMP-2, and MMP-9. Meanwhile, topical treatments reduced cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA-level expression in photodamaged skin, leading to the inhibition of interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) mRNA-level expression. Thus, ginseng phenolic acid-based preparations have potential value as topical treatments to protect skin against UVB-induced photoaging.

Hyaluronan Synthases’ Expression and Activity Are Induced by Fluid Shear Stress in Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells

During biomineralization, the cells generating the biominerals must be able to sense the external physical stimuli exerted by the growing mineralized tissue and change their intracellular protein composition according to these stimuli. In molluscan shell, the myosin-chitin synthases have been suggested to be the link for this communication between cells and the biomaterial. Hyaluronan synthases (HAS) belong to the same enzyme family as chitin synthases. Their product hyaluronan (HA) occurs in the bone and is supposed to have a regulatory function during bone regeneration. We hypothesize that HASes’ expression and activity are controlled by fluid-induced mechanotransduction as it is known for molluscan chitin synthases. In this study, bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hMSCs) were exposed to fluid shear stress of 10 Pa. The RNA transcriptome was analyzed by RNA sequencing (RNAseq). HA concentrations in the supernatants were measured by ELISA. The cellular structure of hMSCs and HAS2-overexpressing hMSCs was investigated after treatment with shear stress using confocal microscopy. Fluid shear stress upregulated the expression of genes that encode proteins belonging to the HA biosynthesis and bone mineralization pathways. The HAS activity appeared to be induced. Knowledge about the regulation mechanism governing HAS expression, trafficking, enzymatic activation and quality of the HA product in hMSCs is essential to understand the biological role of HA in the bone microenvironment.

Ρύθμιση βιοσύνθεσης υαλουρονικού οξέος σε κυτταρικά μοντέλα καρκίνου του μαστού

Ο καρκίνος του μαστού, ένας από τους πιο συχνά εμφανιζόμενους καρκίνους στις γυναίκες, εμφανίζει μεγάλη φαινοτυπική και γονοτυπική ετερογένεια. Ένας από τους σημαντικούς κλινικούς δείκτες που χρησιμοποιούνται για την κατηγοριοποίηση του καρκίνου του μαστού είναι ο υποδοχέας των οιστρογόνων ERα (Estrogen Receptor α). Το 70% των καρκίνων του μαστού διαγιγνώσκονται ως ERα+ όγκοι και εμφανίζουν καλή πρόγνωση, ενώ στους ERα- όγκους παρατηρείται υψηλό ποσοστό μεταστάσεων και κακή πρόγνωση των ασθενών. Σε παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι ο καρκίνος, παρατηρείται έντονη αναδιοργάνωση του εξωκυτταρικού δικτύου μακρομορίων που περιβάλλει τα κύτταρα στους ιστούς. Ένα σημαντικό συστατικό του εξωκυττάριου χώρου είναι το υαλουρονικό, ένας γραμμικός ετεροπολυσακχαρίτης, ο οποίος συντίθεται από διαμεμβρανικά ένζυμα, τις συνθάσες του υαλουρονικού (Hyaluronan Synthases, HASes). Η αυξημένη βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού στους καρκινικούς ιστούς του μαστού συσχετίζονται με υψηλή πιθανότητα δημιουργίας μεταταστάσεων, αντίσταση στις εφαρμοζόμενες χημειο- και ραδιο-θεραπείες και κακή πρόγνωση των ασθενών. Το υαλουρονικό αλληλεπιδρώντας τόσο με μόρια του εξωκυττάριου χώρου όσο και με τους εξειδικευμένους κυτταρικούς υποδοχείς του, όπως ο CD44, ρυθμίζει σχεδόν όλες τις πτυχές της κυτταρικής συμπεριφοράς, όπως η κυτταρική μετανάστευση, η διήθηση, ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση. Με δεδομένο τον σημαντικό ρόλο του υαλουρονικού στη βιολογία των καρκινικών κυττάρων μαστού, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην ανάδειξη και μελέτη αναστολέων της βιοσύνθεσής του. Το 4-methyl-umbelliferone (4-MU) είναι ένα μη τοξικό διαιτητικό συμπλήρωμα που προέρχεται από φυτά, όπως το χαμομήλι, με επιβεβαιωμένη ανασταλτική δράση έναντι της βιοσύνθεσης υαλουρονικού σε διάφορους τύπους κυττάρων. Υποθέσαμε ότι ο υποδοχέας των οιστρογόνων ERα -ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης στην κλινική διαχείριση και θεραπεία του καρκίνου του μαστού- ρυθμίζει διαφορετικά τη βιολογία των καρκινικών κυττάρων μαστού μετά από την επώασή τους με 4-MU. Πράγματι, το 4-MU ανέστειλε τη βιοσύνθεση του υαλουρονικού στα ERα+ και ERα- καρκινικά κύτταρα μαστού, με την ισχυρότερη δράση να παρατηρείται στα κύτταρα που δεν εκφράζουν τον υποδοχέα ERα. Η μείωση του νεο-συντιθέμενου υαλουρονικού συνοδεύτηκε από μεταβολές στα ένζυμα μεταβολισμού του και συγκεκριμένα ελάττωση της συνθάσης HAS2 και επαγωγή των υαλουρονιδασών HYAL-1 και HYAL-2. Επιπλέον, το 4-MU προκάλεσε σημαντικές μορφολογικές αλλαγές, οι οποίες συνοδεύονταν από απώλεια του υποδοχέα του υαλουρονικού CD44 από τις κυτταρικές προεκβολές. Σε λειτουργικό επίπεδο, η επώαση των κυττάρων με 4-MU προκάλεσε σημαντική μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρήθηκαν διαφορετικές επιδράσεις του 4-MU σε καρκινικά κύτταρα μαστού με διαφορετικό προφίλ έκφρασης του ERα. Στα ERα+ κύτταρα, το 4-MU προκάλεσε την επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης ή/και anoikis, ενώ στα ERα- κύτταρα πιθανώς οδήγησε σε στάση του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, το 4-MU ανέστειλε τη μετανάστευση και διήθηση των μεταστατικών ERα- καρκινικών κυττάρων μαστού, ενώ προκάλεσε αύξηση της προσκόλλησής τους σε εξωκυττάριο υπόστρωμα, παρατηρήσεις που συνοδεύτηκαν από σημαντικές μεταβολές στην έκφραση ενζύμων αποικοδόμησης του εξωκυττάριου χώρου και προ-φλεγμονωδών διαμεσολαβητών. Το σαλικυλικό και το ακετυλο-σαλικυλικό (ασπιρίνη) χρησιμοποιούνται εδώ και πολλά χρόνια ως αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Παράλληλα, σύμφωνα με πρόσφατες επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες, εμφανίζουν σημαντικές αντικαρκινικές ιδιότητες. Παρότι ο ρόλος τους και η δράση τους στη φλεγμονή έχει αποσαφηνιστεί, ο ακριβής μηχανισμός της αντικαρκινικής τους δράσης δεν είναι πλήρως γνωστός. Στην παρούσα διατριβή, εξετάσθηκε η δράση του σαλικυλικού -το οποίο παράγεται ταχέως in vivo μετά από την ενζυμική αποακετυλίωση της χορηγούμενης ασπιρίνης από εστεράσες- ως αναστολέα βιοσύνθεσης του υαλουρονικού σε μεταστατικά καρκινικά κύτταρα μαστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σαλικυλικό είναι ικανό να επάγει την άμεση ενεργοποίηση της κινάσης AMPK, η οποία είναι γνωστό ότι φωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί την HAS2, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού στα καρκινικά κύτταρα μαστού. Η παρατηρούμενη αναστολή φαίνεται να ρυθμίζεται από την επάρκεια θρεπτικών συστατικών στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων και από τις ενεργειακές τους ανάγκες. Επιπλέον, το σαλικυλικό επηρέασε την έκφραση μορίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό και τις δράσεις του υαλουρονικού καθώς προκάλεσε μείωση της HAS2 και αύξηση των HYAL-2 και CD44 σε γονιδιακό επίπεδο. Επιπροσθέτως, η επώση των κυττάρων με σαλικυλικό προκάλεσε έντονη υποκυτταρική ανακατανομή του CD44 και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, παρατηρήσεις που συνοδεύτηκαν από μείωση της μετανάστευσης των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μαστού. Τέλος, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι το σαλικυλικό προκαλεί αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης πιθανότατα μέσω στάσης του κυτταρικού κύκλου.Με δεδομένη την ανάγκη ανάπτυξης νέων εκλεκτικών και περισσότερο αποτελεσματικών αναστολέων των συνθασών του υαλουρονικού, εξετάσθηκε η ικανότητα μιας ομάδας νέων συνθετικών χημικών ενώσεων να αναστέλλουν τη βιοσύνθεση του υαλουρονικού. Η παρούσα διατριβή ανέδειξε έναν νέο αναστολέα, τον SMD1736, ο οποίος είναι ένα ανάλογο θυμιδίνης. Ο SMD1736 φαίνεται να είναι κατά περίπου 12.5-φορές δραστικότερος από τον ήδη γνωστό αναστολέα βιοσύνθεσης του υαλουρονικού 4-MU. Η επώαση καρκινικών κυττάρων μαστού με τον SMD1736 προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση γονιδίων του συστήματος του υαλουρονικού (HASes, HYALs, CD44 και RHAMM). Περαιτέρω, η μείωση της βιοσύνθεσης του υαλουρονικού από τον SMD1736 συνοδεύτηκε από αναστολή των επιθετικών ιδιοτήτων μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μαστού. Συγκεκριμένα, ο SMD1736 προκάλεσε σημαντική μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, πιθανώς επάγοντας στάση του κυτταρικού κύκλου, ενώ σημαντική μείωση παρατηρήθηκε επίσης στο μεταναστευτικό και διηθητικό δυναμικό των κυττάρων. Οι μεταβολές αυτές συνοδεύτηκαν από έντονη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και απενεργοποίηση της RhoA GTPάσης. Τέλος, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης των καρκινικών βλαστικών κυττάρων μαστού, η οποία συνοδεύτηκε και από αλλαγές της μορφολογίας των κυττάρων που αναπτύσσονταν σε συνθήκες 3D, μετά από επώαση με τον SMD1736. Συνοψίζοντας, η διδακτορική αυτή διατριβή ανέδειξε και χαρακτήρισε τρεις αναστολείς βιοσύνθεσης του υαλουρονικού σε καρκινικά κυτταρικά μοντέλα μαστού: το 4-MU (υπό το πρίσμα του διαφορετικού προφίλ έκφρασης οιστρογονοϋποδοχέων), το σαλικυλικό (δραστικό συστατικό ενός κλασσικού και ευρέως χρησιμοποιούμενου αντιφλεγμονώδους φαρμάκου, της ασπιρίνης) και μία νέα χημική ένωση, τον αναστολέα SMD1736. Η μείωση των επιπέδων του παραγόμενου υαλουρονικού και της συσσώρευσής του τόσο εξωκυττάρια όσο και ενδοκυττάρια και από τις τρεις χημικές ενώσεις, συνοδεύτηκε από αξιοσημείωτη αναστολή των επιθετικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων μαστού (ιδιαίτερα των μεταστατικών), αναδεικνύοντας τη σημασία της στόχευσης του συστήματος του υαλουρονικού στον καρκίνο του μαστού. Και οι τρεις αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή εμφανίζουν σημαντική αντικαρκινική δράση, καθιστώντας τους χρήσιμα «εργαλεία» για την ανάπτυξη νέων εκλεκτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι ασθενειών οι οποίες χαρακτηρίζονται από αυξημένη βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού, όπως είναι ο καρκίνος του μαστού.

Hyaluronan: Metabolism and Function

As a major polysaccharide component of the extracellular matrix, hyaluronan plays essential roles in the organization of tissue architecture and the regulation of cellular functions, such as cell proliferation and migration, through interactions with cell-surface receptors and binding molecules. Metabolic pathways for biosynthesis and degradation tightly control the turnover rate, concentration, and molecular size of hyaluronan in tissues. Despite the relatively simple chemical composition of this polysaccharide, its wide range of molecular weights mediate diverse functions that depend on molecular size and tissue concentration. Genetic engineering and pharmacological approaches have demonstrated close associations between hyaluronan metabolism and functions in many physiological and pathological events, including morphogenesis, wound healing, and inflammation. Moreover, emerging evidence has suggested that the accumulation of hyaluronan extracellular matrix and fragments due to the altered expression of hyaluronan synthases and hyaluronidases potentiates cancer development and progression by remodeling the tumor microenvironment. In addition to the well-known functions exerted by extracellular hyaluronan, recent metabolomic approaches have also revealed that its synthesis can regulate cellular functions via the reprogramming of cellular metabolism. This review highlights the current advances in knowledge on the biosynthesis and catabolism of hyaluronan and describes the diverse functions associated with hyaluronan metabolism.

Cell Energy Metabolism and Hyaluronan Synthesis

Hyaluronan (HA) is a linear glycosaminoglycan (GAG) of extracellular matrix (ECM) synthesized by three hyaluronan synthases (HASes) at the plasma membrane using uridine diphosphate (UDP)-glucuronic acid (UDP-GlcUA) and UDP- N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) as substrates. The production of HA is mainly regulated by hyaluronan synthase 2 (HAS2), that can be controlled at different levels, from epigenetics to transcriptional and post-translational modifications. HA biosynthesis is an energy-consuming process and, along with HA catabolism, is strongly connected to the maintenance of metabolic homeostasis. The cytoplasmic pool of UDP-sugars is critical for HA synthesis. UDP-GlcNAc is an important nutrient sensor and serves as donor substrate for the O-GlcNAcylation of many cytosolic proteins, including HAS2. This post-translational modification stabilizes HAS2 in the membrane and increases HA production. Conversely, HAS2 can be phosphorylated by AMP activated protein kinase (AMPK), a master metabolic regulator activated by low ATP/AMP ratios, which inhibits HA secretion. Similarly, HAS2 expression and the deposition of HA within the pericellular coat are inhibited by sirtuin 1 (SIRT1), another important energetic sensor, confirming the tight connection between nutrients availability and HA metabolism.

Cnidium officinale Makino Promotes Skin Health via Anti-Inflammation Processes in Various Skin Cell Lines

Background Dermatitis is a worldwide health problem that is associated with quality of life. The skin continuously protects the body from the noxious environment. Cnidium officinale Makino (CM) is an herb used in traditional medicine to treat skin diseases.Methods This study aimed to investigate whether CM exerted antioxidant and anti-inflammatory effects and to describe the effect of CM on the moisturizing and whitening of human mast cells (HMC-1), keratinocytes and melanocyte cells. Antioxidant activity was measured by a DPPH free radical assay. The mRNA expression of hyaluronan synthases 1, 2, and 3, Filaggrin, Claudin-4 and Aquaporin3 was measured by RT-PCR. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase, TRP1, TRP2, AKT, Erk and NF-kB protein levels were evaluated by Western blotting analysis.Results We found that the levels of the DPPH free radical were decreased by CM treatments. CM exhibited anti-inflammatory activities, including the suppression of inflammation-associated molecules. We found that the levels of whitening-related proteins (MITF, tyrosinase, TRP1, and TRP2) were increased with CM treatment compared with α-MSH stimulation in B16F10 cells. CM induced the upregulation of hyaluronan synthases 1, 2, and 3, Filaggrin, Claudin-4 and Aquaporin3 mRNA expression in keratinocytes.Conclusions These findings indicate that CM reduced several inflammatory responses. CM exhibited antioxidant, skin-moisturizing and whitening activity, indicating that CM might be a useful drug for combating inflammation and in skin care.

Adhesive Properties of the Hyaluronan Pericellular Coat in Hyaluronan Synthases Overexpressing Mesenchymal Stem Cells

Hyaluronan (HA), a natural component of the extracellular matrix, is supposed to have a regulatory function in the stem cell niche. Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hMSCs) are known to express all three hyaluronan synthases (HASes), which are responsible for HA production. HA is extruded into the extracellular matrix, but also stays bound to the plasma membrane forming a pericellular coat, which plays a key role during early cell adhesion. Since HAS isoenzymes, HAS1, HAS2 and HAS3, produce HA with different molecular weights, a difference in their role for cell adhesion is expected. Here, we transduced the immortalized hMSC cell line SCP1 to constitutively express eGFP-tagged HASes (SCP1-HAS-eGFP) by lentiviral gene transfer. The overexpression of the HAS-eGFP was shown on RNA and protein levels, HA was determined by ELISA and the stained HA-coat was analyzed using confocal microscopy. Time-lapse microscopy, spreading assay and single cell force spectroscopy using atomic force microscopy were applied to characterize adhesion of the different HAS transduced SCP1 cells. We showed in this study that HAS3 overexpressing cells formed the thickest pericellular coat compared with control or HAS1 and HAS2 transduced cells. Furthermore, SCP1-HAS3-eGFP displayed faster and stronger adhesion compared to cells overexpressing the other synthases or control cells. We conclude that overexpression of HASes in hMSCs differentially modulates their initial adhesive interactions with the substrate. This observation might be helpful in regenerative medicine goals.