Integrated computational and experimental methods for the characterization of the frequency and functional consequences of RNA editing in microRNAs

Η ανακάλυψη των μικρών RNAs (microRNAs, miRNAs) τη δεκαετία του 1990 και άλλων κλάσεων μη-κωδικοποιών RNAs (non-coding RNAs, ncRNAs), δημιούργησε ένα πεδίο εντατικής έρευνας. Στο χώρο αυτό αναδείχτηκε η σημασία της μελέτης των αλληλεπιδράσεων των ncRNAs, τόσο μεταξύ τους όσο και με κωδικοποιά μετάγραφα (messenger RNAs, mRNAs). Η βιοπληροφορική ανάλυση αποτελεί κύριο μέσο για τη χαρτογράφηση και σύγκριση της αφθονίας των κωδικοποιών και μη-κωδικοποιών RNAs και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους, τόσο σε παθολογικές όσο και σε φυσιολογικές καταστάσεις. Η πρόοδος της βιοτεχνολογίας επέτρεψε την ανάπτυξη πληθώρας πειραμάτων αλληλούχησης υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας (high-throughput experiments), τα οποία αποφέρουν τεράστιο όγκο βιολογικών δεδομένων. Η ανάλυση και αξιοποίηση των δεδομένων αυτών βασίζεται εξ' ολοκλήρου σε αλγορίθμους και υπολογιστικές μεθοδολογίες αιχμής. Η αξιοποίηση και ενσωμάτωση (integration) συνόλων δεδομένων από πειράματα Αλληλούχησης Επόμενης Γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) επιτρέπει την ανάπτυξη μεθόδων/μοντέλων που αναπαριστούν ή καταγράφουν με πιστότητα τη βιογένεση, το μηχανισμό δράσης, καθώς και τις τροποποιήσεις των ncRNAs και επιτρέπουν τη μελέτη βιολογικών μηχανισμών, την ανάδειξη θεραπευτικών στόχων και διαγνωστικών βιοδεικτών. Η παρούσα διατριβή επικεντρώνεται στην πιο εντατικά μελετούμενη κατηγορία ncRNAs, τα miRNAs. Πρόκειται για RNAs μήκους περίπου 22 νουκλεοτιδίων που δρουν ως ισχυροί μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης, στοχεύοντας κωδικοποιά (mRNA) και μακρά μη-κωδικοποιά (π.χ. long non-coding RNA, lncRNA) μετάγραφα σε μικρές ακολουθίες τους που αποκαλούνται Στοιχεία Αναγνώρισης από miRNAs (miRNA Recognition Elements, MREs). Κατά τη στόχευση, τα miRNAs προσδένονται στα MREs με βάση σύνθετους κανόνες τέλειας ή ατελούς συμπληρωματικότητας του RNA, επάγοντας την καταστολή της μετάφρασης και/ή την αποικοδόμησή του. Η πλειοψηφία των βιολογικών διεργασιών στα ανώτερα θηλαστικά ρυθμίζεται από τη δράση των miRNAs.Η μετα-μεταγραφική τροποποίηση (RNA editing) των miRNAs από εξειδικευμένα ένζυμα αποτελεί μια φυσιολογική βιολογική διεργασία που μεταβάλλει το ρεπερτόριο στόχευσής τους. Η μεταβολή αυτή δύναται να είναι ήπια ή δραστική, ανάλογα με τη θέση στην οποία λαμβάνει χώρα η τροποποίηση. Τα πειράματα NGS επιτρέπουν την ταυτόχρονη μελέτη του RNA editing σε όλα τα μεταγραφθέντα RNAs, όμως η αναγνώριση συμβάντων τροποποίησης μέσα από αυτά αποτελεί πρόκληση· οι παρατηρούμενες αλλαγές στη γνωστή ακολουθία των RNAs ενδέχεται εναλλακτικά να οφείλονται στην παρουσία μεταλλαγών στο επίπεδο του DNA ή σε σφάλματα κατά την αλληλούχηση.Κατά τη διατριβή αυτή σχεδιάστηκε αλγόριθμος ταυτοποίησης περιστατικών RNA editing στα miRNAs, ο οποίος συνδυάζει σύνολα δεδομένων Αλληλούχησης των Μικρών RNAs (small RNA Sequencing) με πληροφορίες για την παρουσία μεταλλαγών, προερχόμενες από Βάσεις Δεδομένων αναφοράς ή πειράματα Αλληλούχησης του Γονιδιώματος (Whole Genome Sequencing) του ίδιου ατόμου, ιστού, ή της ίδιας πειραματικής συνθήκης. Ο αλγόριθμος αξιοποιήθηκε για την ταυτοποίηση συμβάντων RNA τροποποίησης στην ακολουθία των miRNAs σε υγιείς/καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές. Πέραν της καταγραφής των πιο επιφανών περιπτώσεων τροποποίησης, τα miRNAs που βρέθηκαν τροποποιημένα υποβλήθηκαν σε ανάλυση για να αναδειχθεί η μεταβολή στο ρεπερτόριο στόχευσής τους, χρησιμοποιώντας αλγορίθμους αιχμής για την εύρεση των στόχων τους. Επίσης, μελετήθηκαν συγκριτικά χαρακτηριστικά της εξελικτικής συντήρησης και της θερμοδυναμικής ευστάθειας των ακολουθιών των miRNAs στα οποία παρατηρούνται φαινόμενα RNA τροποποίησης. Κατά την εκπόνηση του διδακτορικού μου, συμμετείχα σε 7 δημοσιευμένες εργασίες σε επιστημονικά περιοδικά υψηλού κύρους (μία παρουσίαση εργαλείου ποσοτικοποίησης των μικρών RNAs, τρεις εργασίες σχετικές με τη μελέτη της στόχευσης mRNAs/lncRNAs από miRNAs, μία παρουσίαση Βάσης Δεδομένων με συσχετίσεις της αφθονίας μικροβίων με ασθένειες και δύο μεταγραφωματικές μελέτες δράσης εμβολίων ενάντια στη λεϊσμάνια), καθώς και στη συγγραφή ενός κεφαλαίου βιβλίου αναφορικά με τις υπολογιστικές μεθόδους μελέτης των miRNAs. Έχω παρουσιάσει ερευνητικά ευρήματα συνολικά σε 7 επιστημονικά συνέδρια-ημερίδες (4 εθνικά, 3 διεθνή), και έχω συμβάλει στη διοργάνωση του Πανευρωπαϊκού Συνεδρίου Βιοπληροφορικής ECCB’18 και της 5ης Ημερίδας Μεταπτυχιακών και Μεταδιδακτόρων του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, το 2019. Σύμφωνα με το Google Scholar οι εργασίες στις οποίες μετέχω έχουν μέχρι στιγμής λάβει 356 αναφορές. Στις 7/12/2016 έγινε δεκτή η αίτησή μου στο Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών για χρηματοδότηση διατριβής με αντικείμενο την υπολογιστική και πειραματική μελέτη του RNA editing φαινομένου στα microRNAs, μέσα από μια υποτροφία διάρκειας 36 μηνών.