Formulation of mayonnaise recipe enriched with biological active compounds of sesame cake

Today, scientific schools have been formed to improve the recipe and technology of mayonnaise. In the present study, a byproduct of an oilseed source, namely sesame cake, containing unique antioxidant compounds, such as lignans, is studied as a biologically active additive that can be used in the place of starch and synthetic antioxidants in mayonnaise. Sesame seed purchased from local markets. Sesamol standard was obtained from Sigma Chemical Company (USA). The experimental results have shown that regarding the taste, color, mouthfeel, and overall acceptability, the samples containing 10% sesame cake powder obtained the highest score. It is therefore recommended to use sesame cake powder at the concentration of 8-10% in mayonnaise formulation. The findings of this research could be useful for food industries to improve their products qualitatively.

Effect of Aegle Marmelos Hydroethanolic Leaf Extract on Expression of Antiapoptotic Markers in Human Melanoma Cells

Background: Aegle marmelos commonly known as Bael is a herbal plant. Itis from a family called Rutaceae. It has many medicinal uses: anti-diarrheal, anti- microbial, anti-viral, anti-cancer, chemo-preventive, Ulcer healing and many others. Aim: To study the effect of Aegle marmelos hydroethanolic leaf extract on expression of antiapoptotic markers in human melanoma cells. Objective: The present study investigated the effect of Aegle marmelos hydroethanolic leaf extract on expression of antiapoptotic markers in human melanoma cells. Materials and Methods: DMSO and MTT chemicals were purchased from Sigma chemical Pvt Ltd. Trypsin EDTA, FBS, RPMI 1640 medium and PBS, Real time PCR kit was purchased from Canada. Human melanoma cell line (A375) was purchased from NCCS, Pune, India. Results: The data was analysed statistically by ANOVA and Duncan’s multiple range test with a computer based software (Graph Pad Prism version 5). The percentage of cell viability decreases with the increase in dosage of Aegle marmelos leaf extract. Conclusion: The study concluded that Aegle marmelos hydro ethanolic leaf extract a novel and innovative herbal drug has a significant effect on the expression of antiapoptotic markers in human melanoma cell lines.

КЛЮЧОВІ ФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ У КЛІТИНАХ БРИЖОВИХ ЛІМФАТИЧНИХ ВУЗЛІВ НАЩАДКІВ ЩУРІВ З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИМ ГЕСТАЦІЙНИМ ДІАБЕТОМ

Гестаційний діабет (ГД) є важливим порушенням обміну речовин, що може впливати на морфогенез органів імунної системи. Мета дослідження – з’ясувати особливості змін функціонального стану клітин брижових лімфатичних вузлів у нащадків щурів з експериментальним гестаційним діабетом (ЕГД). Матеріали і методи. Дослідження проведено на 80 нащадках щурів лінії Wistar з ЕГД віком 1 і 6 місяців. Для індукції ЕГД вводили внутрішньочеревно стрептозотоцин (SIGMA Chemical, США) у дозі 45 мг/кг. Для ідентифікації TLR2, TLR4, NOD2, RIGI, T-bet, Nlrp3, RORγt і Foxp3 у гістологічних зрізах лімфатичних вузлів застосовували імунофлюоресцентний метод. Для дослідження експресії мРНК генів Aire, Deaf1, Foxp3, IL10, Ctla4, Cxcr4, Ccr7, Madcam1, S1pr1 використовували метод полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією в режимі реального часу. Результати. Встановлено комплекс ключових патофізіологічних і функціональних змін у клітинах брижових лімфатичних вузлів (БЛВ) у нащадків щурів з ЕГД: зміни експресії регуляторів рециркуляції і хоумінгу лімфоцитів; порушення формування периферичної імунологічної толерантності; активація патернрозпізнавальних рецепторів уродженої імунної системи на лімфоцитах БЛВ; зміни розподілу ефекторних Т-клітин в БЛВ. Висновки. Пренатальна гіперглікемія призводить до посилення прозапальної сигналізації та активації компонентів уродженої імунної системи більш виразно на 1 місяці життя.

EFEK IMPLANTASI HORMON LHRH-A PADA IKAN BOTIA (Botia macracantha Bleeker) TERHADAP KERAGAAN PEMATANGAN GONADNYA

Induk ikan Botia (Botia maeracantha Bleeker) hasil tangkapan dari Sungai Batang hariJambi, telah diimplantasi dengan hormon LHRH-a des Gly10 [D - Ala6] Sigma Chemical pada dosis 100, 150, 200 pg/kg bobot badan induk. Percobaan dilakukan pada awal Januari 1995.

Η ανοσολογική απόκριση ολικού ανθρώπινου αίματος σε πρόκληση με στοιχεία του τοιχώματος μυκήτων

Η σήψη αντιπροσωπεύει ένα σοβαρό πρόβλημα υγείας, που σχετίζεταιμε υψηλή θνητότητα και θνησιμότητα, παρατεταμένη παραμονή για νοσηλείαστο Νοσοκομείο, και αυξημένα άμεσα και έμμεσα κόστη. Ειδικά στην ΜΕΘ, ησήψη είναι το πρώτο αίτιο θανάτου. Ακολούθως με τα αποτελέσματα τηςμελέτης Sepsis Occurrence in Acutely Ill Patients (SOAP), 35% των βαρέωςπασχόντων ασθενών αναπτύσσουν σήψη σε κάποιο σημείο της νοσηλείαςτους στην ΜΕΘ, με θανατηφόρες επιπλοκές στο 27% από αυτές, έναποσοστό που πλησιάζει το 50% σε ασθενείς με σηπτικό σοκ. Τα Grampositive[gram (+)] βακτήρια έχουν αναδειχθεί ως το συχνότερο αίτιο λοίμωξηςτων βαρέως πασχόντων ασθενών, ακολουθούμενα από τα gram-negative[gram (-)] βακτήρια και από τους μύκητες, οι οποίοι εμπλέκονται σε περίπου18% των περιπτώσεων.Η ΧΝΑ συχνά επιπλέκεται από λοιμώξεις, ειδικά όταν φτάνει στο τελικότης στάδιο που απαιτεί αιμοδιάλυση. Η θνητότητα των ασθενών με τελικούσταδίου ΧΝΑ είναι περίπου 20%, με τις καρδιαγγειακές παθήσεις και τιςλοιμώξεις να ενοχοποιούνται για το 70% των θανάτων. Η αυξημένη επίπτωσητης σήψης στους ασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΑ είναι πολυπαραγοντική καιαποδίδεται στην ουραιμία, την υποθρεψία, και την διαδικασία αιμοδιάλυσης, ηοποία μπορεί να επηρεάσει πολλαπλώς τόσο την εγγενή όσο και την επίκτητηανοσία. Η υπεργλυκαιμία είναι ένας καλά μελετημένος παράγοντας πουευοδώνει σε λοιμώδεις επιπλοκές. Η διαταραγμένη ομοιόσταση της γλυκόζηςεπηρεάζει πολλές παραμέτρους της ανοσιακής απάντησης,συμπεριλαμβανομένης της εκκρίσεως κυτταροκινών, της λειτουργίας των κυττάρων της ανοσίας και της επιθηλιακής δυσπραγίας. Οι ασθενείς με ΣΔείναι συνήθως εξαιρετικά επιρρεπείς σε λοιμώξεις.Αμέσως μετά μια μικροβιακή προσβολή η φλεγμονώδης απάντησηξεκινάει μετά την αναγνώριση των συστατικών του μικροβιακού εισβολέα. Οικύριες προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες είναι ο TNF-α και οι ιντερλευκίνεςIL-6,IL-1β, and IL-8, οι οποίες προωθούν την φλεγμονώδη αντίδραση καιπροκαλούν την εμφάνιση του Συνδρόμου Συστηματικής ΦλεγμονώδουςΑντίδρασης {Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)}.Ταυτόχρονα με την προφλεγμονώδη διέγερση, ξεκινάει και ηαντιφλεγμονώδης, η οποία αντιπροσωπεύεται κυρίως από την IL-10. Ηκυριαρχία του προφλεγμονώδους ή του αντιφλεγμονώδους προφίλ σχετίζεταιμε την κλινική έκφραση της λοίμωξης και την έκβαση της σήψης αμφότερα.Η παθογένεση της gram(-) σήψης έχει μελετηθεί εκτεταμένως καιαποδίδεται σχεδόν αποκλειστικά στη δράση του λιποπολυσακχαρίτη(ενδοτοξίνη, LPS) του βακτηριακού τοιχώματος. Το κυτταρικό τοίχωμα τωνμυκήτων αποτελείται από τρείς κυρίως ομάδες πολυσακχαριδών, πολυμερήτης μανόζης (μαννοπρωτεΐνες, 40% της ξηρής μάζας του κυτταρικούτοιχώματος), πολυμερή της γλυκόζης (b-γλυκάνη, 60% της ξηρής μάζας τουκυτταρικού τοιχώματος) και πολυμερή της N-acetylglucosamine (χιτίνη, 2%της ξηρής μάζας του κυτταρικού τοιχώματος). Ανάμεσα σε αυτά οι μαννάνεςέχουν ιδιαίτερη σημαντικότητα, καθώς παρέχουν αντιγονική πολυμορφία καικατέχουν ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες.Παρότι είναι βολικό να πιστεύουμε ότι μια κοινή παθογενετική οδόςαποτελεί την βάση σε όλες τις σηπτικές προσβολές, φαίνεται να υπάρχειδιαφορετικότητα ανάμεσα σε διαφορετικά είδη βακτηρίων. Σκοπός της μελέτης: Ο κύριος σκοπός της παρούσης μελέτης είναι νααξιολογήσει την βασική ανοσιακή κατάσταση των ασθενών των ευπαθών σεμυκητιασικές λοιμώξεις, και να αξιολογήσει την ανοσολογική τους απάντησημετά διέγερση με συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων και νασυγκριθεί αυτή η αντίδραση με την αντίδραση υγειών εθελοντών ενηλίκων,χρησιμοποιώντας ένα ex vivo μοντέλο διέγερσης. Ένας δευτερεύων σκοπόςήταν να διαπιστωθεί το εάν αυτέ οι ομάδες ασθενών ευρίσκονται σεκατάσταση ανοσοπαράλυσης, κάτι που αναγνωρίζεται με ολοένα καιαυξανόμενη συχνότητα σε βαριά πάσχοντες ασθενείς.Υλικό και μέθοδος: Μετρήσαμε τα βασικά επίπεδα των κυτταροκινών τουορού καθώς και τα επίπεδα που παρήχθησαν αυτές μετά από ex vivoδιέγερση με μαννάνη σε ολικό αίμα που συνελέγη από 10 υγιείς εθελοντές, 10ασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΑ, 10 ασθενείς με ΣΔ και 10 ασθενείς πουβρίσκονταν στη 2η ημέρα νοσηλείας τους σε ΜΕΘ, οι οποίοι είχαν μη σηπτικόSIRS και είχαν ένα APACHE II score ≥25. Χρησιμοποιήσαμε 100 μg/mlμαννάνης για μια περίοδο επώασης 8 ωρών ώστε να διεγείρουμε 1 ml ολικούαίματος. Τα δείγματα του αίματος συνελέγησαν από περιφερική φλέβα και ηδιέγερση έλαβε χώρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες για όλες τις ομάδες μεμαννάνη από Saccharomyces cerevisiae της εταιρείας Sigma Chemical Co.(St Louis, MO, USA). Η μέτρηση των κυτταροκινών έγινε χρησιμοποιώνταςειδικά για το ανθρώπινο είδος εμπορικά διαθέσιμα κιτ με ELISA γιακυτταροκίνες.Αποτελέσματα: Όλες οι ομάδες των ασθενών είχαν υψηλότερες βασικέςτιμές TNF-α, IL-6, IL-1β, και IL-10 συγκρινόμενες με την ομάδα ελέγχου, αλλάμόνο στους ασθενείς της ΜΕΘ οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές. Ο λόγος IL-10/IL-6 βρέθηκε 0.33, 0.22 και 0.96 αντίστοιχα στους υγιείς, τουςασθενείς με ΧΝΑ και τους ασθενείς με ΣΔ, και 1.32 για τους ασθενείς τηςΜΕΘ πριν την διέγερση και 0.22, 0.51, 1.21, 2.46 αντίστοιχα μετά τηνδιέγερση. Σε όλες τις εξετασθείσες ομάδες, τα επίπεδα των κυτταροκινώναυξήθηκαν σημαντικά μετά την διέγερση με την μαννάνη, αν και οι βαριάπάσχοντες ασθενείς εμφάνισαν σημαντικά μικρότερη μεταβολή. Δενδιαπιστώθηκε ανοσοπαράλυση σε όλες τις εξετασθείσες ομάδες, αν καιυπήρξε σχετική ανοσοπαράλυση στους ασθενείς με ΣΔ και στους ασθενείςτης ομάδας της ΜΕΘ σύμφωνα με τον λόγο IL-10/Il-6. Επιπλέον, σύμφωνα μετον λόγο IL-10/TNF-α, όλες οι ομάδες ασθενών έχουν υψηλότερη πιθανότηταθανάτου σε σύγκριση με τους υγιείς εθελοντές, με αυτούς της ομάδας τηςΜΕΘ στην κορυφή της επικινδυνότητας και ακολουθούμενους από τουςασθενείς της ομάδας του ΣΔ. Ο λόγος IL-10/TNF-α πριν και μετά από τηνδιέγερση ήταν 0.52/0.35, 0.77/0.64, 0.96/0.91 και 1.46/1.19 για τους υγιείςεθελοντές, την ομάδα της ΧΝΑ, τους ασθενείς με ΣΔ και την ομάδα της ΜΕΘαντίστοιχα.Συμπεράσματα: Οι βαρέως πάσχοντες ασθενείς και δευτερευόντως οιασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΑ καθώς και οι ασθενείς με ΣΔ βρίσκονται σεπροφλεγμονώδη κατάσταση. Η ανταπόκριση των ασθενών με ΧΝΑ και ΣΔστην διέγερση με μαννάνη κρίνεται ως ικανοποιητική και συγκρίνεται με τηναντίδραση των υγειών ενηλίκων, ενώ αυτή των βαρέως πασχόντωνδιαφοροποιείται, πιθανά εξαιτίας της διαφορετικής ανοσολογικής τουςκατάστασης. Οι ασθενείς της ΜΕΘ και δευτερευόντως οι ασθενείς με ΣΔ είχανσχετική ανοσοπαράλυση.

First Report of Cucurbit chlorotic yellows virus Infecting Cucumber, Melon, and Squash in Iran

Yellowing diseases of field- and greenhouse-grown cucurbits are becoming increasingly important in many cucurbit cultivation areas in Iran. Virus surveys were conducted from 2011 to 2012 in greenhouse-grown cucumber (Cucumis sativus L.) and field-cultivated cucumber, squash (Cucurbita sp.) and melon (Cucumis melo L.) in Tehran, Semnan, Bushehr, Hormozgan, Isfahan, Yazd, and Fars provinces, the major cucurbit-growing areas in Iran. Leaf samples with various symptoms, e.g., chlorosis, interveinal chlorotic spots on lower leaves, bright yellow color or sever yellowing on older leaves, were collected and screened for the presence of the whitefly transmitted criniviruses (family Closteroviridae) Cucurbit chlorotic yellows virus (CCYV) and Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) through double-antibody sandwich (DAS)-ELISA, using CCYV and CYSDV specific antisera (DSMZ, Germany). The ELISA results showed that of 347 cucumber leaf samples originating from cucumber greenhouses, 170 and 65 were positive for CCYV and CYSDV, respectively, and 45 samples were infected with both viruses. In addition, of 147 leaf samples collected from melon, cucumber, and squash grown in open fields, 57 and 53 were infected with CCYV and CYSDV, respectively, and 14 were infected with both viruses. These results indicate that these two viruses are widely distributed on these cucurbit crops in Iran. CCYV was not detected in Bushehr and CYSDV was not detected in Isfahan and Hormozgan provinces. To confirm the presence of CCYV and CYSDV, total RNA was extracted (Sigma Chemical, St. Louis, MO) from 18 samples that reacted positive in DAS-ELISA originating from different surveyed provinces. RT-PCR was carried out using specific primers Crini-s2 (5′-CATTCCTACCTGTTTAGCCA-3′) (2) and Crini-as1 (5′-ATCCTTCGCAGTGAAAAACC-3′) to amplify a 460-bp fragment of the HSP70 gene and CCYV using specific primers CCYV-HSP-F1 (5′-TGCGTATGTCAATGGTGTTATG-3′) and CCYV-HSP-R1 (5′-ATCCTTCGCAGTGAAAAACC-3′) to amplify a 462-bp fragment of the HSP70 gene (latter 3 primers from [3]). Expected DNA fragments for CYSDV and CCYV were amplified from 11 (CCYV 7/11, CYSDV 4/11) of 18 samples but not from any of the healthy controls. Further analysis by sequencing three selected PCR products amplified with primers CCYV-HSP-F1/R1 showed complete consensus among the sequences, and in comparison with sequences available at GenBank, the highest identities were obtained to Asian CCYV isolates (94% nt/98% aa identity). The CCYV sequences were deposited in GenBank under accessions KC559449 to KC559451. The identity of the amplified CYSDV DNA could also be confirmed by sequencing of three PCR products. CCYV has first been proven to occur in different countries in East Asia and has recently been reported from Sudan (2) and Lebanon (1), indicating the putative spread of the virus wherever cucurbits are grown and its vector, the whitefly Bemisia tabaci, is present. Large populations of whiteflies were present in all surveyed areas. However, to our knowledge, this is the first report for the occurrence of CCYV in Iran. In conclusion, the presence of CCYV and CYSDV in the major cucurbit growing provinces and the large whitefly population pose a serious threat to cucurbit production in Iran. References: (1) P. E. Abrahamian et al. Plant Dis. 96:1704, 2012. (2) K. Hamed et al. Plant Dis. 95:1321, 2011. (3) R. Zeng et al. Plant Dis. 95:354, 2011.

360 EMBRYONIC DEVELOPMENT AND STEROIDOGENESIS OF BOVINE CUMULUS - OOCYTE COMPLEXES MATURED IN α-MEM MEDIUM SUPPLEMENTED WITH PVA OR PVP-40

The influence of the culture medium and its supplements on IVM and steroid secretion by bovine COCs was examined. Immature COCs were matured for 24 h in a-MEM supplemented with IGF-1 (10 ng mL-1), insulin (100 ng mL-1) and 0.1% polyvinyl alcohol (PVA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) or 0.1% polyvinylpyrrolidone-40 (PVP; molecular weight of 40 000; Sigma). Neither FSH nor LH was used in either treatment. The control group consisted of COCs matured in TCM supplemented with FSH (20 μg mL-1) and 10% estrous cow serum. After fertilization, presumptive zygotes were co-cultured with cumulus cells until 224 h post-insemination. Steroid production was measured in culture medium after IVM and cumulus cells (CC) aromatase activity was estimated by estradiol (E2) production and by the determination of the ratio of E2 to testosterone (T). Cleavage, blastocyst, and hatching rates were evaluated 168-224 h post-insemination. Hormone determination data were analyzed using the GraphPad 5.0 for Windows software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). The means and standard deviations were first calculated for all variables, followed by the Kolmogorov-Smirnov normality test. Since the values were not normally distributed, the treatments were compared by the Kruskal-Wallis test. Blastocyst formation, cleavage, and hatching rates were analyzed by the chi-square test. The level of significance was set at P < 0.05 in all analyses. High aromatase activity (E2:T ratio > 1.0) was detected in the culture medium of both chemically defined IVM systems. E2 concentrations were 22.86 ng mL-1 and 22.46 ng mL-1 for PVA and PVP-40, respectively, and 0.27 ng mL-1 (P < 0.001) for the control group. Progesterone secretion was lower in a-MEM + PVP-40 medium. Testosterone was not secreted by COCs matured in control medium. There was a significantly higher cleavage rate in the control group, but no differences (P > 0.05) in blastocyst (48.92%, 49.56%, and 44.21%) or hatching (38.46%, 41.96%, and 40.78%) rates between the PVA, PVP, and control groups, respectively. Our results show that CC of COCs cultured in serum-supplemented medium show decreased aromatase activity. Also, the addition of IGF-I/insulin and PVA or PVP-40 to IVM medium had no significant effect on the rates of oocyte maturation and embryonic development when compared with results obtained in medium supplemented with estrous cow serum and FSH. Supported by FAPESP/FAEPA-HCFMRP/USP.

244 DEVELOPMENT OF SUPEROVULATORY STRATEGIES IN ALPACAS

The objective of the present study was to determine the ovarian response of alpacas to different treatments for follicular development and superovulation. Twenty-nine mature, lactating alpacas, between 31 and 56 days postpartum, managed in the Peruvian highlands (altitude = 4100 m) were randomly distributed into 4 experimental groups. Groups 1 (n = 7) and 3 (n = 8) received a homemade intravaginal sponge containing 60 mg of medroxyprogesterone acetate (MAP; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) plus 2 mL of PGF2α (IM; Illiren�; Intervet International, Boxmeer, The Netherlands) on Day 0. Groups 2 (n = 7) and 4 (n = 7) received 2 mL of PGF2α (IM) on Day 0, but did not receive a MAP sponge. All groups received 6 injections (IM) of FSH (Folltropin V�; Bioniche Animal Health, Beltsville, Ontario, Canada) in decreasing dosages of 50, 50, 30, 30, 20, and 20 mg, respectively, every 12 h (at 0700 and 1900 h each day), plus 300 IU of eCG (IM; Folligon�; Intervet International) at the time of the last FSH treatment, with the aim of increasing LH levels. The FSH treatments started on Days 7, 5, 9, and 7 (from Day 0) in groups 1–4, respectively. MAP sponges were removed at the time of the last FSH treatment in groups 1 and 3. All alpacas were naturally mated twice at 12 and 24 h after the last FSH treatment. Alpacas in groups 1 and 2 received 3000 IU of hCG (IM; Corulon�; Intervet International) and alpacas of groups 3 and 4 received 2.5 mL of GnRH (IM; Conceptal�; Intervet International) immediately after the first mating. Seven days after the first mating, ovaries of all alpacas were examined by transvaginal ultrasonography. Ovarian response was estimated by determining the number of CL present on each ovary. The numbers of follicles that were at least 8 mm in diameter were also counted. Data were analyzed as a complete randomized design with 4 treatments. The average number of CL per alpaca was 1.3, 1.00, 1.00, and 0.9 for groups 1 to 4, respectively (P &gt; 0.05). The average number of follicles that were at least 8 mm in diameter per alpaca was 9.4, 20.4, 0.9, and 3.9 for groups 1 to 4, respectively (P ≤ 0.05) with females in group 2 showing the highest response. We conclude that progestin treatment did not affect ovulatory response of lactating alpacas to exogenous gonadotropins. An effective ovarian stimulation strategy for achieving superovulation in alpacas remains to be developed.

First Report of Cucurbit aphid-borne yellows virus in Iran Causing Yellows on Four Cucurbit Crops

A survey was conducted from 2001 to 2004 in the major cucurbit-growing areas in Iran to reassess the relative incidence of cucurbit viruses. Severe yellowing symptoms were observed frequently on older leaves of cucurbit plants in various regions in outdoor crops, suggesting the presence of Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV, genus Polerovirus, family Luteoviridae) (1,2). Leaf samples (n = 1019) were collected from plants of melon (Cucumis melo L.), cucumber (C. sativus L.), squash (Cucurbita sp.), and watermelon (Citrullus lanatus L.) showing various virus-like symptoms (mosaic, leaf deformation, yellowing). All samples, collected from 15 provinces, were screened for the presence of CABYV by double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) with IgGs and alkaline phosphatase-conjugated IgGs against a CABYV reference isolate (1). Of the 1,019 samples tested, 471 were positive for CABYV using DAS-ELISA. Some of the positive samples had typical severe yellowing symptoms while symptoms in other samples were masked by mosaic or leaf deformations caused by other viruses frequently found in mixed infections (data not shown). During the entire survey, CABYV was detected by DAS-ELISA in 201 of 503 melon samples, 72 of 129 cucumber samples, 158 of 249 squash samples, and 40 of 138 watermelon samples. These results indicate that CABYV is widely distributed on four cucurbit species in the major growing areas of Iran. In order to confirm CABYV identification, total RNA extracts (TRI-Reagent, Sigma Chemical, St Louis, MO) were obtained from 25 samples that were positive using DAS-ELISA originating from Khorasan (n = 4), Esfahan (n = 6), Teheran (n = 3), Hormozgan (n = 4), Azerbaiejan-E-Sharqi (n = 4), and Kerman (n = 4). Reverse transcription-polymerase chain reactions (RT-PCR) were carried out using forward (5′-CGCGTGGTTGTGG-TCAACCC-3′) and reverse (5′-CCYGCAACCGAGGAAGATCC-3′) primers designed in conserved regions of the coat protein gene according to the sequence of a CABYV reference isolate (3) and three other unpublished CABYV sequences. RT-PCR experiments yielded an expected 479-bp product similar to the fragment amplified with extracts from the reference isolate. No amplification of the product occurred from healthy plant extracts. To our knowledge, this is the first report of the occurrence of CABYV in Iran on various cucurbit species. The high frequency (46.2%) with which CABYV was detected in the samples assayed indicates that this virus is one of the most common virus infecting cucurbits in Iran. References: (1) H. Lecoq et al. Plant Pathol. 41:749, 1992 (2) M. A. Mayo and C. J. D'Arcy. Page 15 in: The Luteoviridae. H. G. Smith and H. Barker, eds. CAB International Mycological Institute, Wallingford, UK, 1999. (3) H. Guilley et al. Virology 202:1012, 1994.

89 EVALUATION OF A CUSHIONED CENTRIFUGATION TECHNIQUE FOR PROCESSING BOAR SEMEN FOR FREEZING

Boar semen freezing procedures include the use of centrifugation to concentrate sperm and remove seminal plasma prior to dilution in freezing extender. The centrifugation techniques employed have necessarily been a compromise between the need to recover as many spermatozoa as possible after centrifugation and the damage caused by pelleting the sperm. The use of an inert, dense, and isotonic solution as a cushion in the bottom of the tube leads to the use of higher-speed centrifugation to ensure maximum sperm recovery. However, it is necessary to know the viability and functionality of the samples after the thawing process. The aim of this work was to evaluate the effect of cushion-technique centrifugation on the in vitro sperm viability and the penetrating capacity after thawing. Sperm-rich fractions from five fertile boars were diluted and cooled to 15°C before centrifugation. Two centrifugation regimes were used: 800g for 10 min called the “standard method” (SM) (Westendorf P etal. 1975 Dtsch. Tierzartl Wochenschr. 82, 261–267) and 1000g for 20 min on an iodixanol isotonic solution 60% w/v gradient (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) called the “cushion method” (CM). Spermatozoa were diluted in lactose/egg-yolk extender, cooled to 5°C over 2 h and then frozen with glycerol and Equex by classic methodology (Westendorf P et al. 1975 Dtsch. Tierzartl Wochenschr. 82, 261–267). Frozen sperm samples were thawed in a circulating water bath at 38°C for 30 s. To detect increases in plasma membrane lipid packing disorder and viability, frozen-thawed samples of sperm were stained with merocyanine 540 (M540) and Yo-Pro 1 (Harrison et al. 1996 Mol. Rep. Dev. 45, 378–391) and evaluated by flow cytometry. In vitro penetration ability was assessed using the homologous in vitro penetration (hIVP) test with immature oocytes (Gadea and Matas 2000 Theriogenology 54, 1343–1357). ANOVA analysis revealed that centrifugation by CM showed higher values of intact viable spermatozoa than SM centrifugation (60.21 v. 54.68%, P < 0.05). The in vitro penetration assay showed no differences in penetration rate or mean number of sperm penetrated per oocyte. However, significant boar and interaction effects were found (P < 0.01). These results indicated that different effects of the treatment were found for every boar. In conclusion, the cushioned centrifugation method gives a simple means of processing porcine semen for freezing more efficiently without loss of fertilizing capacity. This work was supported by AGL-2003-03144.